| 实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液和溶液
丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺（29:1) (%, m/V)
过硫酸铵（10%，m/V）
乙醇
6X 凝胶载样缓冲液
KOH/甲醇
硅化液（如 Sigmacote 或 Acrylease)(可选或不选）
5X TBE 电泳缓冲液
TEMED
2. 核酸和寡核苷酸
DNA 样品
3. 专用设备
夹子或铁皮制纸夹（6~8 个，2 inch/5 cm 宽）
电泳装置，玻璃板，梳子和间隔片
凝胶密封带
凝胶测温条（可选或不选）
微量移液器及拉长的塑料洗头
凡士林
注射器（50 ml)
二、方法
安装电泳装置和配制凝胶溶液
1. 必要时可用 KOH/甲醇清洗玻璃板和间隔片。
2. 用温热的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片，再充分漂洗，先用自来水，再用去离子水。应拿取玻璃板的边缘部分或戴手套操作，以免手上的油脂残留在玻璃板的工作面上。用乙醇冲洗玻璃板，并将其置于一边晾干。
3. (可做可不做）其中一块玻璃板的一面用硅化液处理（如 Sigmacote 或 Acrylease): 在化学通风橱内，将玻璃板放于一叠纸巾上，倒少量硅化液于其表面上，用 Kimwipes 纸巾涂抹均匀，然后用去离子水冲洗、纸巾擦干。
4. 安装玻璃与间隔片：
(1) 将较大的（不带凹口）玻璃板平放在实验台上，在玻璃板的两侧将间隔片平行置于其边缘放妥。
(2) 用凡士林轻涂以助于间隔片在后面的操作中保持原位。
(3) 将内板（带凹口的玻璃板）在间隔片上放妥。
(4) 用夹子或铁皮制纸夹将玻璃板夹在一起，将整块玻璃板的两边及底部用凝胶密封带封紧，形成不透水密封。
5. 根据玻璃板的大小和间隔片的厚度计算所需凝胶的体积。制备适宜浓度的凝胶溶液。
6. (可做可不做）将所需用量的聚丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰溶液放于一干净的带侧臂的烧瓶中，加入磁力搅拌子，抽真空脱气。开始脱气应温和一些，并边脱气边旋转烧瓶直至不再有气泡溢出为止。
灌制凝胶
7. 下面的操作需要戴手套，在托盘上进行，以免溅出的丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液洒在实验台上。动作应迅速，于丙烯酰胺聚合前完成。
(1) 每 100 ml 丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液中加入 35 μl TEMED, 轻轻旋转混匀溶液。
(2) 用 50 ml 注射器吸取凝胶溶液，调转注射器，排净进入针管的空气。将注射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙烯酰胺溶液，几乎注满该空隙。
(3) 将玻璃板斜靠在试管架上，与实验台面成约 10° 角。
8. 立即将合适的梳子插入到凝胶中，小心勿使梳齿下留有气泡。梳子的顶端应略高于玻璃板的上沿。用铁皮制纸夹将梳子夹紧，使其就位。必要时，用剩余的丙烯酰胺溶液完全充满模具。确认无丙烯酰胺溶液从模具里漏出。
9. 丙烯酰胺于室温聚合 30~60 min。若凝胶回缩明显，应补加丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺溶液。
10. 聚合完全后，用 1X TBE 浸润的纸巾包绕梳子和凝胶的顶部。然后用 Saran Wrap 膜密封整块凝胶，4℃ 保存，直至使用。
11. 当准备好进行电泳时，在梳子的周围及其顶部喷些 1X TBE 缓冲液，从聚合的凝胶中小心取出梳子。用注射器吸取 1X TBE 冲洗加样孔。用剃须刀或解剖刀除去凝胶底部的密封胶带。
上样与电泳
12. 将凝胶放入电泳槽中，用大号铁皮制夹子夹住其进缘或用装置本身的夹子固定。带凹口的玻璃板应面对缓冲液槽向里放置。
13. 用配制凝胶溶液同一批次的 5X TBE 配制电泳缓冲液灌满缓冲液槽。用一根弯头巴斯德吸管或注射器针头排除藏匿于凝胶底部的气泡。
14. 用巴斯德吸管或注射器再次吸取 1X TBE 冲洗加样孔。将 DNA 样品与适量 6X 凝胶载样缓冲液混合，用 Hamilton 注射器或带有拉长的塑料吸头的微量移液管加入加样孔。
15. 将电极与电源相连（正极接下槽)，打开电源，进行电泳。
16. 电泳至标准参照染料迁移至所需位置。关闭电源，拔掉插头，弃去电泳槽中的电泳缓冲液。
17. 卸下玻璃板，用解剖刀或剃须刀片除去凝胶密封胶带。将玻璃板放在实验台上 （硅化的玻璃板在上面)。用间隔片或塑料楔将上面的玻璃板的一角撬起。检査一下凝胶仍应附着在下面的玻璃板上。将上面的玻璃板平稳的移开，去掉间隔片。
18. 检测聚丙烯酰胺凝胶中 DNA 条带的位置。 |
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