ELISA方法学：开发实践中不可不知的亲和力测定方法开发1
一、前言
目前用于测定受体配体间的亲和力，也就是解离平衡常数的方法，主要有：
热力学测定方法
动力学测定方法
饱和浓度法
其中动力学测定方法和饱和浓度法较为通用：动力学测定方法（如Biacore）涉及到比较昂贵的仪器投入，饱和浓度测定法为国内绝大多数生物药物企业常用的测定方法。
ELISA用于亲和力的测定是饱和浓度测定法的主流模式，常用于抗原蛋白或者抗体的蛋白水平的活性评估和抗体的长期稳定性评价等。
ELISA用于亲和力测定往往没有商业化的试剂盒，需要实验人员进行方法学开发。
由于生物技术这方面教育缺失和新药研发企业在此应用的积累不够，一个能够通过方法学验证的ELISA亲和力测定方法对于很多从业人员来说是一件难度较大的事情，而且很有可能出现谬误如新号传递错误或者偏差等。
其中最大的一个谬用是采取ELISA定量的实验条件进行ELISA亲和力测定方法的开发。
本文从亲和力的测定方法的基本原理入手，描述饱和浓度法亲和力测定的基本原则，概述ELISA方法开发过程中的抗原抗体的剂量关系，以及在ELISA用于亲和力测定方法应用时可能会出现的几个错误，并为大家介绍通用的亲和力测定的方案和初步的方法学开发的方案。
二、亲和力基本概念
我们通过分析几个化学反应案例，和大家解释一下什么叫做亲和力。
例子A
氢气和氧气在点燃的条件下生成水。
在反应停止时，如果在反应环境中氢气的摩尔浓度恰巧是氧气的摩尔浓度的2倍时，两者皆被消耗，反应环境中只有水；如果氢气的摩尔浓度大于氧气的摩尔浓度的2倍时，氧气被消耗，反应环境中只有氢气和水；果氢气的摩尔浓度小于氧气的摩尔浓度的2倍时，氢气被消耗，反应环境中只有氧气和水。
这是关于化学反应的基础知识，化学反应进行的结果，反应物能够完全变为生成物，即反应能进行到底，有此类反应的过程和结果特性的反应称之为不可逆反应。
例子B
PD1抗原（CD279）和PD1抗体（如pembrolizumab）在常温常压下反应。
在反应停止时，如果反应环境中CD279的摩尔浓度为200nM,
pembrolizumab的摩尔浓度是100nM时，在理想条件下pembrolizumab-CD279复合物的浓度为97.86nM,
CD279的摩尔浓度为4.28nM, pembrolizumab为2.14nM;
如果反应环境中CD279的摩尔浓度为100nM, pembrolizumab的摩尔浓度是200nM时，在理想条件下pembrolizumab-CD279复合物的浓度为49.81nM, CD279的摩尔浓度为0.38nM, pembrolizumab为159.19nM。
例子C
PD1抗原（CD279）和PDL1抗原（CD274）在常温常压下反应。
如果反应环境中CD279的摩尔浓度为200nM, CD274的摩尔浓度是100nM时，在反应完成时理想条件下CD274-CD279复合物的浓度为2.35nM, CD279的摩尔浓度为197.65nM，CD274的摩尔浓度是97.65nM；
如果反应环境中CD279的摩尔浓度为100nM, CD274的摩尔浓度是200nM时，在反应完成时理想条件下CD274-CD279复合物的浓度为2.35nM, CD279的摩尔浓度为97.65nM，CD274的摩尔浓度是197.65nM，绝大多数CD279和CD274并未参与反应。
案例B、C两种情况下，无论是抗原和抗体（配体和受体）结合反应，两者反应有生成复合物的正反应过程，也有复合物解离反应生成抗原、抗体逆反应过程，最终的结果是抗原，抗体和抗原-抗体复合物三者共存的状态。
这样的反应称之为可逆反应。
当一个可逆反应中正反应和逆反应的速度相等时，反应体系中抗原的浓度、抗体的浓度和抗原-抗体复合物浓度不再增加也不再减少，可逆反应完成，反应体系中各成分摩尔浓度处于动态平衡。
亲和力(Affinity)是可逆反应过程中抗原、抗体和抗原-抗体复合物之间的相对状态的特征参数，其更加专业性和术语化的名称是解离平衡常数KD，单位mol/L(和浓度单位一致)。
