ELISA方法学：开发实践中不可不知的亲和力测定方法开发3
08用洗涤液洗板4次，拍干；
09取酶联抗体对应的显色液，临用前20分钟拿出平衡到室温，在漩涡混合器上混匀；
10使用8道排枪以100 ul/孔加入显色液；
11显色液室温避光放置10-30分钟 （Note 5）；
12使用8道排枪以100 ul /孔加入终止液终止反应（根据底物的不同，此步骤可能不需要）；
13用酶标仪测定信号值（Note 6）；
14结果分析（Note 7）。
贴心小NOTE
Note1：如果需要减少反应过程中高浓度的抗体（100000ng/ml）对酶标板材的非特异吸附，在包被过程中，建议选择疏水性酶标板材（polysorp）,包被的抗原浓度需要少量0.2-1ug/ml，具体情况需要根据抗原抗体的亲和力大小来进行判断优化。一般来说亲和力越强，所需的抗原包被浓度越低。
Note2：封闭液不一定能起到封闭效果，需要实验验证（未包被抗原的分组），一般来讲分子量越小的封闭剂效果越佳。
Note3：在方法学开发的初期可以拉大一下标准曲线的浓度范围100000ng/ml-0.1ng/ml，以得到有明显上下平台期的全曲线，当抗原抗体间亲和力较强时，梯度浓度可缩小，稀释的倍数可在方法学优化过程中缩小至2倍。
Note4：酶联抗体效应过量，酶联抗体的稀释需要做不同的稀释度进行比较选择，对于单抗成分的酶联抗体，如果高低两个稀释度的酶联抗体能够产生一样的剂量曲线，说明酶联抗体过量，ELISA的信号传递未产生偏差。
对于多抗成分的酶联抗体，其稀释度的判断较为复杂，可以初略计算下酶联抗体的摩尔浓度要高于包被上的抗原摩尔浓度的5倍以上。当酶联抗体浓度较小时，酶联抗体在高剂量不同浓度的抗体条件下均被抓到，曲线有假上平台。
Note5：对于吸光度值底物和荧光底物，仪器检测的信号值和显色时间成正比，控制在10-30分钟为宜。需要提前确认检测仪器的信号线性范围，比如一般的酶标仪吸光度值的信号线性范围在0-3，吸光度值在3-4之间为非线性的，在显色时应控制信号值不要超过3，当信号值超过线性范围时，曲线有假上平台。
Note6：不同底物需要用不同的仪器进行检测，吸光度读值，荧光读值，化学发光读值。在底物选择过程中注意实验室的酶标仪是否具备该种类型的读数功能。
Note7：标准的剂量曲线拟合一般用四参数拟合，需要有明显的上下平台期（A，D值），斜率一般在0.8-1.2（B值）之间，EC50（C值）即为抗体相对于抗原的亲和力值。
五、总结
根据饱和浓度法，采用ELISA进行亲和力测定时，需要有明显的四参数S型曲线，即需要有随抗体浓度渐进变化的信号曲线。
在抗体低浓度和高浓度时有明显的上下平台期，上平期信号值的一半对应的抗体浓度（EC50）值即抗原抗体间亲和力KD值。
由于仪器的检测信号的线性范围是有限，当信号超过线性范围时会使曲线进入假上平台期使得测得的亲和力不准。
包被的抗原浓度直接决定了信号的最大信号值，所以在用ELISA进行亲和力测定时，包被的抗原浓度尽量要小，以得到合适的信号值；酶联抗体浓度过低时也可能使曲线进入假平台期。
在ELISA方法学开发过程中，酶联抗体过量以保证信号的线性传递需要经过实验验证。
当信号无法得到有效的上平台期时，说明抗原抗体间的亲和力太弱或者包被抗原过多，需要更大浓度的抗体才能使得所有抗原被完全抓住以达到平台期。
受限于ELISA灵敏度的限制，在一些亲和力较弱（>100nM）的抗体抗原中，采用ELISA方法基本得不到有效的平台期，也无法测得准确的亲和力数值。
ELISA进行亲和力测定评价抗原的活性或者测定抗体活性时，得到的EC50并非越小越好，信号进入假平台期（达到仪器的检测极限，酶联浓度较小）均会使EC50变小，从而得到错误的亲和力数据，这也是ELISA进行亲和力测定时最容易产生的谬误。
如今很多抗原蛋白的供应商关于抗原活性的评价均存在此类谬误。
抗原和抗体间的亲和力是有两者的结构和相互作用决定的，可能是0.1 nM,1 nM或者1000 nM。评价ELISA亲和力测定方法的好坏需要看此EC50值是否和亲和力的值相符，亲和力的值可通过热力学测定方法，动力学测定方法和饱和浓度法中的细胞流式测定法等多方面验证。
反过来说当一个ELISA方法不存在诸如信号进入假平台期（达到仪器的检测极限，酶联浓度较小）等谬误时，其EC50值才能真实的反应亲和力的数值。
采用ELISA进行方法学开发需要明确应用目的，大分子定量和亲和力测定。
不同的应用目的，抗原和抗体的相对剂量浓度会有很大的差异，有不同的剂量曲线，读者可以结合上篇《ELISA方法学开发实践版-生物大分子检测的定量方法开发》进行对比研究，明晰差异。
