液相色谱-原子荧光联用测定海带和紫菜中的砷形态
液相色谱-原子荧光联用测定海带和紫菜中的砷形态
1970-01-01 海光仪器
摘要：不同价态或形态的砷具有不同的毒性和生物可利用性，传统的仅以元素总量为依据的研究方法已不能满足现代科学发展的需要[1]，为建立液相色谱-原子荧光联用技术测定海产品中的砷的方法[2]，本文研究了前处理方法（提取法和消解法）、酸介质与酸度等因素对测定的影响，在最佳工艺条件下，砷的四种常见组分的最小检出量分别为：三价砷：0.20ng，二甲基砷：0.25ng，一甲基砷：0.32ng，五价砷：0.57ng，方法的回收率为80%～110%，精密度（RSD）分别为2.2%，2.2%，2.5%，2.8%，适用于海产品中砷的测定。
关键词：液相色谱-原子荧光联用，海产品，三价砷，二甲基砷，一甲基砷，五价砷
1. 前言
越来越多的研究表明，元素的毒性、生物可利用性、迁移性和再迁移性与元素的化学形态息息相关[3]，而元素的化学形态与食品安全又存在着千丝万缕的联系。近年来，食品的安全问题倍受人们的关注。砷是食品中的有害元素，而不同价态或形态的砷具有不同的毒性和生物可利用性，它不易被微生物降解，一定条件下可转化为毒性很强的砷有机化合物，且有致癌作用，因此，不同价态或形态的砷在食品中含量的测定已经成为食品监测的必测项目。自然界常见的砷形态有六种，即亚砷酸盐As（Ⅲ）、砷酸盐As（Ⅴ）、一甲基胂酸（MMA），二甲基胂酸（DMA）、砷甜菜碱（AsB）和砷胆碱（AsC），而前两种无价砷毒性最大[4]，本实验选取的样品是海带和紫菜。
2 试验部分
2.1原理
在液相高压泵的作用下，利用阴离子交换色谱住可以将已处理的样品溶液中各种组分分离开来，然后，各组分进入检测系统，在酸性介质中，处理后的样品中所含砷的不同价态或形态与硼氢化钾反应在氢化物发生系统中生成砷的氢化物，由载气带入原子化器中，氢气和氩气在特制点火装置的作用下形成氩氢火焰，使待测元素原子化。砷空心阴极灯发射的特征谱线通过聚焦，激发氩氢焰中的砷原子，基态原子被激发至高能态，在去活化回到基态时，如果以辐射的形式释放能量，就会发射出特征波长的荧光，其荧光强度与砷的含量成正比，与标准系列比较定量。
2.2 仪器
LC-AFS-9800液相色谱-原子荧光联用仪（北京海光仪器公司），编码砷空心阴极灯，可编程断续流动进样装置。
所用玻璃仪器，均需用（1+1）硝酸浸泡过夜，再用去离子水冲洗干净，晾干，备用；
2.3 试剂与试剂配制
氢氧化钠（NaOH）：分析纯；硼氢化钾（KBH4）：分析纯；
磷酸氢二钠（Na2HPO4）：分析纯；磷酸二氢钾（KH2PO4）：分析纯；
盐酸（HCl）：优级纯；硝酸（HNO3）：，优级纯；高氯酸（HClO4，）：优级纯；
硼氢化钾（20 g/L）-氢氧化钠混合溶液（5 g/L）：称取硼氢化钾14.0 g，氢氧化钠2.5 g，用去离子水溶解，定容至500 mL，混匀。（也可称取10 g硼氢化钠代替14 g硼氢化钾，溶于5 g/L的氢氧化钠溶液中。）
洗脱液（Na2HPO4-KH2PO4）：称取0.8954 gNa2HPO4和3.026 g KH2PO4，溶解于500 mL高纯蒸馏水中，PH大约5.92，经过滤、超声脱气后备用。
盐酸（5%，V/V）：量取25 mL盐酸，缓缓倒入500 mL水中，混匀备用；
本试验用水均为高纯蒸馏水；
三价砷、二甲基砷、一甲基砷、五价砷标准溶液：购买自国家标准物质研究中心；
砷标准储备溶液（1000 μg/L）：将1000 μg/mL砷标准溶液用高纯蒸馏水逐级稀释至1000 μg/L。
2.4 样品预处理
2.4.1 湿法消解
称取样品粉末0.5~1.0 g，置于50~100 mL锥形瓶中，同时做两份试剂空白。加8 mL浓硝酸与2 mL高氯酸的混合酸，摇匀后放置过夜。置于电热板上加热消解，若消解液处理至1 mL左右时仍有未分解物质或色泽变深，取下放冷，补加硝酸5~10 mL，再消解至2 mL左右观察，如此反复两三次，注意避免炭化，继续加热至消解完全后（消解液颜色无色或淡黄色），持续蒸发至高氯酸的白烟散尽，剩约0.5 mL，冷却，用水将内溶物转入50 mL容量瓶或比色管中，用高纯水定容并混匀，使得酸度约为1%，备测。
2.4.2 水浴提取
称取样品粉末0.5~1.0 g，置于50 mL带盖的塑料瓶中，同时做两份试剂空白。加入1%的硝酸溶液10 mL，置于沸水浴中，每30 min震摇1 min，加热3 h，然后冷却至室温，在离心机中以800 0r/min的速率离心15 min，取上层清液，经0.45 μm的滤膜过滤后待测。
2.5 校准曲线的制备
单标配制：
亚砷酸盐As（Ⅲ）：以砷计浓度75.7 μg/mL；
用移液枪取20 μL上述标准液，用高纯水定容至1.5 mL，浓度为1000 ng/mL；
砷酸盐As（Ⅴ）：以砷计浓度17.5 μg/mL；
用移液枪取86 μL上述标准液，用高纯水定容至1.5 mL，浓度为1000 ng/mL；
一甲基砷（MMA）：以砷计浓度25.1 μg/mL；
用移液枪取60 μL上述标准液，用高纯水定容至1.5 mL，浓度为1000 ng/mL；
二甲基砷（DMA）：以砷计浓度52.9 μg/mL；
用移液枪取28 μL上述标准液，用高纯水定容至1.5 mL，浓度为1000 ng/mL；混标的配制，见下表：
|
标准使用液浓度（ng/mL） |
标准使用液体积（μL） |
定容体积（mL） |
混合溶液标准浓度（ng/mL） |
|
1000 |
20 |
2 |
10 |
|
1000 |
40 |
2 |
20 |
|
1000 |
80 |
2 |
40 |
|
1000 |
100 |
2 |
50 |
2.6 样品测定
2.6.1 仪器条件
液相高压泵条件：阴离子交换色谱住，流速：1.000 mL/min，进样体积：100 μL，泵压：Pmax=30 MPa，Pmin=0 MPa，柱压：7～8 MPa。
原子荧光条件：光电倍增管负高压：290 V，空心阴极灯电流：60 mA，原子化器高度：8.0 mm，温度：300 ℃；氩气流速：载气流速400 mL/min，屏蔽气流速800 mL/min；测量方式：标准曲线法；读数方式：峰面积；读数时间：13 s；延迟时间：3 s；硼氢化钾溶液加液时间：18.0 s。
2.6.2 测定方法
设定好仪器各部分的合适条件，先用高纯蒸馏水冲洗柱子约30 min，再进流动相平衡色谱柱约30 min，同时将炉温升至所需温度后预热。
首先用所配混标的最高浓度点进行组分设定，然后分别输入四种组分标准溶液的浓度值，开始采集数据以及拟合曲线，最后进行样品测定。
3 结果与讨论
3.1湿法消解测定结果：
|
样品 |
As（Ⅲ） |
DMA |
MMA |
As（Ⅴ） |
|
海带/ng/mL |
0 |
52.0450 |
0.9120 |
0.1243 |
|
紫菜/ng/mL |
0 |
67.2540 |
2.7150 |
0.2765 |
稀酸提取测定结果：
|
样品 |
As（Ⅲ） |
DMA |
MMA |
As（Ⅴ） |
|
海带/ng/mL |
54.217 |
45.8930 |
0.2200 |
9.2930 |
|
紫菜/ng/mL |
98.9270 |
47.0970 |
0.4170 |
0 |
3.2 仪器参数的选择
液相高压泵流速的选择是根据柱子的最佳条件设定；光电倍增管负高压增大，灵敏度提高，但噪声也相应增大，即空白值高，综合考虑选择290 V。荧光信号随灯电流的增大而增强，同时考虑荧光信号强度和灯的使用寿命，在此试验中选择60 mA。载气流速在300～500 mL/min时，荧光强度基本稳定，载气流速再增大时荧光强度反而下降；屏蔽气流速大于800 mL/min时，荧光强度趋于恒定。在此选择载气流速300 mL/min，屏蔽气流速800 mL/min。
3.3 介质及酸度的选择
试验表明砷离子在盐酸、硝酸与硫酸介质中均能够被硼氢化钾还原成砷的氢化物蒸气，并且酸的种类对测定结果影响不大；另外，砷的测定对酸的酸度要求范围较宽，经过对标液中不同酸及酸度的考察，发现在盐酸溶液中砷元素的荧光信号略强，当盐酸浓度在5%～20%范围内时，砷的荧光强度变化不大，但盐酸浓度低于2%时，荧光强度显著降低，综合考虑，本实验选择5%的盐酸作为介质，并使标准溶液与样品溶液酸度匹配。
3.4 硼氢化钾浓度的选择
硼氢化钾的浓度太低时，砷元素还原不完全，荧光信号弱，低于5 g/L时，基本上没有荧光信号，当浓度高于10 g/L时，才有比较高的荧光强度，且随着硼氢化钾浓度增加荧光强度增加，同时提高了测量的灵敏度和稳定性，但是，过多的硼氢化钾与氢离子生成的大量氢气也会稀释氢化物的浓度，本实验选择硼氢化钾的浓度为20 g/L。
3.5 线形范围、标准曲线与最小检出量
标准曲线与线形范围：
As（Ⅲ）：IF = 17.56429 * C +10.71，相关系数：r=0.9996；
As（Ⅴ）：IF = 4.157143 * C -6.39，相关系数：r=0.9941；
DMA：IF = 10.25714 * C +3.36，相关系数：r=1.0000；
MMA：IF = 11.60714 * C -8.64，相关系数：r=0.9993；
最小检出量：
选取任一浓度的混标，采集谱图，然后进行基线采集，得到各组分的最小检出量：As（Ⅲ）0.20ng，As（Ⅴ）0.57ng，MMA：0.32ng，DMA：0.25ng。
4. 结论
对于海产品，在合适的工作条件下，用不同方法处理试样，所得结果有所差别，通过实验数据可以发现：湿法消解处理的样品比较彻底，其中一些大分子砷糖裂解成小分子而被检测出来，并且海产品中毒性小的有机砷含量远远高于毒性大的无机砷含量；而用稀酸提取方法得到的不仅是无机砷，还有一部分有机砷，这与以前的相关报道不一致。通过大量资料表明，海产品适用于湿法消解处理。液相色谱-原子荧光联用法测定海产品中不同价态或形态砷的方法具有分离彻底，灵敏度高、检出限低、共存元素干扰小、线性范围宽，方法快速简便等优点。且仪器是国内专有仪器，便于推广，适用于海产品中砷的测定。
参考文献
[1] Caruso J A，Sutton K L，Ackley K L，Eds. Elemental Speciation;Comprehensive Analytical Chemistry,Vol. XXXⅢ;Tokyo:Elsevier,2000.
[2] [2] GB/T 5009.11-1996，食品中砷的分析方法[S].
[3] 严秀平，尹学博，余莉萍，《原子光谱联用技术》[M]，北京：化学工业出版社，2005.3。
[4] 胡斌，江祖成，《色谱-原子光谱/质谱联用技术及形态分析》[M]，北京：科学出版社，2005。
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