MALDI TOF 在临床微生物检测中的应用
自从2015年美、中两国陆续推出了“精准医疗计划”后，“精准医疗”就一直备受社会各界的广泛关注。临床微生物检验在感染性疾病诊断、用药指导、抗菌药物管理、医院感染控制等方面对实施精准医疗起着至关重要的作用。近年来，由于抗菌药物的滥用导致多种细菌耐药以及新型细菌的出现，使得目前临床上对微生物种类的鉴定工作更加困难。 传统的微生物鉴定基于革兰氏染色和微生物代谢生化反应, 操作过程复杂，仍无法实现快速鉴定。因此，临床微生物实验室亟需新的检验技术，以满足实施精准医疗的发展需求。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）技术，是20世纪80年代末问世并于近年迅速发展起来的一种新型软电离质谱技术，是目前分子定性能力最强的分析方法。将质谱法应用于微生物鉴定是微生物检验方法的一次技术性革命。与传统的鉴定相比，简化了鉴定流程，缩短了鉴定时间，具有准确、快速、灵敏及高通量等优点，并可对完整的病原菌细胞和临床样本进行直接检测。
MALDI-TOF MS主要由三部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）、飞行时间质量分析器（TOF）和检测器。MALDI的原理：微量样品与过量小分子基质在靶板上形成共结晶薄膜，基质通常为有机芳香弱酸，主要包括2，5-二羟基苯甲酸（DHB）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸（SA）、甲酸（FA）等。不同的待测样品要选择不同的基质，通常蛋白质样品采用CHCA或SA。当激光照射样品与基质的共结晶时，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，同时将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离和气化。这一技术适合于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据离子在飞行管内的飞行速度与离子的质荷比（m/z）成正比，不同m/z值的样品到达检测器的飞行时间不同，从而实现对质荷比不同的样品分子的鉴定(见图一)。MALDI-TOF MS鉴定微生物主要是通过检测未知菌种获得微生物的蛋白质谱图，并将所得的谱图与数据库中的微生物参考谱图比对后得出鉴定结果。
图一 MALDI-TOF MS的工作原理
目前市场上有三种商业MALDI-TOF系统可用于微生物鉴定：MALDI Biotyper系统（Bruker Daltonics，德国），Vitek MS系统（BioMérieux，法国）和Clin-TOF II系统（北京毅新博创生物科技有限公司，中国)。
众多研究显示，利用MALDI-TOF MS已经能鉴定出大部分细菌。革兰阳性菌中葡萄球菌、肠球菌在种水平的鉴定准确率近乎100%，其他阳性菌如乳酸球菌、李斯特菌、棒状杆菌等也能被质谱技术准确鉴定出来。革兰阴性菌如肠杆菌、奈瑟菌、耶尔森菌和弧菌等的鉴定也都获得了良好的结果。质谱技术还可用于分枝杆菌的鉴定。对1990-2015年国外公开发表的关于MALDI-TOF MS检测分枝杆菌的文献进行了荟萃评价后, 合并得出飞行质谱技术鉴定分枝杆菌属的正确率为91%。这也显示了MALDI-TOF MS对分枝杆菌属的鉴定有较好的准确性。
另外，厌氧菌的鉴定在内源性感染性疾病中受到了广泛的关注，目前只有少量的研究分析了MALDI技术在厌氧菌鉴定方面的应用，主要原因是数据库中厌氧菌的参考谱图还比较少。厌氧菌的前处理方法与普通细菌相同，由于多数厌氧菌生长速度较需氧菌慢，应适当延长培养时间。MALDI-TOF MS现已能实现对临床常见厌氧菌及许多少见厌氧菌菌种（普雷沃菌、梭杆菌、梭菌、拟杆菌和革兰阳性厌氧球菌等）的准确鉴定，并且结果优于传统生化试验方法。 2014年在一项对106份厌氧菌的研究中，MALDI-TOF与传统技术的鉴定结果一致率可达95.3%。
在真菌鉴定方面，大部分文献已报道MALDI-TOF MS可以用于常规酵母菌的监测，并发现该技术鉴定酵母菌的准确率达到85.2%。此外，质谱还可以准确地区分近平滑念珠菌、拟平滑念珠菌、似平滑念珠菌复合体以及鉴别新型隐球菌和格特隐球菌亚种。丝状真菌由于所需培养时间长、传统鉴定方法具有局限性，使用MALDI-TOF MS进行对其鉴定更能体现其优势。丝状真菌由于细胞壁难以破碎，鉴定前需要特殊的前处理方式。使用旋转培养法进行菌株的液体培养或使用超声波裂解细胞等改良方法进行前处理可以明显改善鉴定结果。有研究显示MALDI-TOF在丝状真菌菌种水平鉴定的精确率达95.4%。
今年三月有一项研究通过自建旋毛虫MALDI-TOF数据库，成功将测试样本鉴定到种，与传统方法，充分显示了MALDI-TOF快速、准确和低廉的特点。这是首次将质谱技术用于食源寄生虫的鉴定。
今年初有文献报道在MALDI-TOF MS直接鉴定基础上，对阳性血培养中常见细菌进行了直接药敏试验，其结果与常规药敏试验结果高度相符，且直接药敏试验的报告周转时间比常规缩短了24小时。 其它实验室也有用不同方法直接从血培养瓶检测细菌，鉴定正确率为31.8%~95%不等。也有研究人员应用MALDI-TOF技术在中段尿样本中分析细菌蛋白质，从而直接检测不同种类的细菌，并且对混合感染的样本有一定的鉴别能力。质谱技术对血、尿标本的直接鉴定可以大幅提高检测速度，但其推广还需形成标准化方法。
除鉴定正常的微生物菌群外，MALDI-TOF也被用于耐药菌株的鉴定。有早期研究发现MALDI-TOF可以将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）与甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）区分开来。另一研究通过检测头孢噻肟与69株G-菌孵育后水解产物的量，表明MALDI-TOF在检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的G-菌中具有潜在的临床价值，今后可在临床微生物实验室广泛开展。也有研究表明，通过agr和sigB调控系统的表达情况，可以评估金黄色葡萄球菌感染宿主的不同状态，MALDI-TOF质谱技术获取的m/z特征能够直观快捷地判断这一状态，该技术的深度应用有待进一步开发。
从2015年开始，国内外陆续有应用MALDI-TOF MS进行聚类分析的报道。它能对多种细菌（大肠埃希菌，肺炎克雷伯氏菌，鲍曼不动杆菌，鼠伤寒沙门菌），甚至耐药菌（产EBSL的大肠埃希菌，MRSA）进行准确的同源性分析，其结果和PFGE等分型方法较为一致。PFGE的实验方法操作繁琐、检验周期耗时较长、试剂成本相对昂贵。与之相比，MALDI-TOF MS是一种简便、快速、高通量的方法。建立MALDI分型的标准化方法对传染病监测、传染源追踪、流行病暴发调查和院感监控等有非常重要的意义。
MALDI-TOF MS在临床微生物菌种鉴定领域的应用，除了技术本身，更重要的是依赖于质谱菌种鉴定数据库。数据库中图谱的质量、数量都将直接影响鉴定的成功率与准确率。目前的Biotyper和Vitek MS的数据库中较多是国外菌种，不一定能符合中国临床的需求。Clin-TOF II的数据库是在国家疾控中心、军科院、协和医院、301医院、302医院、微生物所等合作单位的协助下建立的超过2200种，7900株的谱库，更加适合中国国情。由于病原微生物有地域差别，实验室在原有数据库基础上也可补充建立本地病原微生物的质谱指纹图谱库，提高鉴定成功率。
总之，MALDI-TOF MS是一项快速、操作简单、准确鉴定病原微生物的新型技术。该方法的使用可以优化实验室检测流程，节省检验时间和成本，将为临床诊治提供很大的帮助，有非常好的应用前景。随着质谱技术的发展，操作规程不断规范化，以及病原微生物数据库的完善，MALDI-TOF方法必将成为新一代临床微生物鉴定的重要技术。
400-6699-117 转 8868
