RT-PCR扩增目的基因cDNA
实验概要
学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。
实验原理
普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（d T）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。
主要试剂
1、RNA模板
2、cDNA引物
3、反转录缓冲液
4、dNTP
5、AMV反转录酶
6、RNA抑制剂（RNasin）
7、Taq酶
8、10×PCR缓冲溶液
9、引物（P1、P2）
主要设备
1、PCR扩增仪
2、电泳仪
3、台式离心机
4、恒温水浴
5、紫外分析仪
6、微量移液器
实验步骤
一、RNA的反转录
1、在小管中依次加入
5 ul RNA
6 ul DEPC H2O
混合后,65℃×5 min(破坏二级结构).
2、置于冰浴5 min.
3、在管中依次加入: (反应体系为20 ul)
RT buffer ( 5×)4 ul
RNasin0.5 ul
dNTP ( 10mM)2 ul
Oligo T17A（G／C） （50-100 uM） 1 ul
AMV反转录酶1 ul
置于 42℃× 1 h。
4、70℃× 5 min（使酶失活，可省略）。
5、加入100ul ddH2O (从总RNA开始制备)或1000 ulddH2O（从mRNA开始制备）。
6、置于-20℃保存备用.
二、PCR扩增DNA
在灭菌的0.5ml PCR管中，依次加入
20μl cDNA
10μl 10×PCR buffer
5μl dNTP
2μl RT引物I
2μl RT引物II
1μl Taq DNA聚合酶
加ddH2O 补足50μl ，混匀。
PCR程序：
94 ℃ 3 min
95 ℃ 30 s
35 cycles: 55 ℃ 60 s
72 ℃ 90 s
72 ℃ 10 min
三、PCR产物的鉴定
取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
