病毒颗粒的等电位滴定曲线用于指导离子交换层...（一）
病毒颗粒的等电位滴定曲线用于指导离子交换层析工艺开发
病毒颗粒的等电位滴定曲线用于指导离子交换层析工艺开发
S. Herzer1, P. Beckett 1 , T. Wegman 2, and P. Moore1
1Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ, USA; 2Mayo Clinic, Rochester, MN, USA
使用电泳滴定曲线（ETC）测定病毒颗粒的电荷性质，是层析纯化法过程中的一个部分。病毒颗粒的CyDye™ 标记和使用Typhoon™扫描仪对其在凝胶中的检测是一种快速且灵敏的工具，可以用于预测完整病毒在离子交换柱上的层析行为。ETC结果有助于离子交换介质和分离条件的选择。 本文报告了腺病毒和麻疹病毒的结果。该方法也适用于腺相关病毒（AAV）、鼠白血病病毒和细菌噬菌体如lambda和M13等。
前言
电泳滴定曲线（ETC）是测定预置的pH范围内生物分子电荷性质的强有力的工具。蛋白质混合物的ETC有大量的参考文献[1-10] ，并且它们常用于离子交换层析法的评估和预测[1, 7] 。
基因治疗和疫苗对大量高纯度病毒颗粒的要求，使得层析分离纯化倍受关注[11-14] 。病毒颗粒的复杂性和易碎性影响了实验中对其电荷性质的估计。在pH梯度中的琼脂糖凝胶电泳具有环境相对温和的优点。我们在此描述了一种快速、可重复的、敏感的方法，为进行完整病毒颗粒的层析分离确定一个有用的工作pH。
材料
除特殊说明外，包括细菌噬菌体在内的全部材料都来自Amersham Biosciences公司。制备缓冲液的一般化学药品都来自Sigma, Aldrich。SYPRO™ Ruby来自Molecular Probes。所有其他的病毒都来自ATCC，麻疹病毒除外(由Rochester, MN 梅奥诊所的M. Federspiel教授友好捐赠）。
方法
CyDye™荧光标记在能保持病毒稳定性的弱碱性pH环境中完成。 为避免过度标记和交联仅使用单活性基染料。标记环境保持在低的温度(在冰上）或在短时间内进行，以确保病毒颗粒的表面电荷性质不被过度标记所影响。
其他的步骤都按照制造厂家的说明书进行，除非另有说明。琼脂糖ETC凝胶中加入5%甘油以防止发生凝集，这种凝集在被扫描的凝胶上显示为大片弥散。
按照如下程序在PhastSystem™快速凝胶电泳仪上运行琼脂糖ETC凝胶：第一步，以2000V,20 mA/gel , 15 , 7 W ℃ 经110Vh，以形成pH梯度；在110 Vh时停止电泳，将凝胶旋转90°。在第一步和第二步期间仔细标记阴极的方向。 应用只包含完整的除去盐分的病毒颗粒或细胞溶解产物的样本，使用跨过凝胶的宽度和pH梯度的滴定曲线点样器或小的切口加样。病毒样本在1000V 20 mA/gel, 15 , 7 W ℃ ，经40-60Vh被电荷/pH所分离。经适当设置的Typhoon扫描仪间隔扫描分离的过程。
按照制造厂家的说明书控制琼脂糖ETC凝胶在快速电泳仪上运行，并在Typhoon扫描仪上用SYPRO Ruby观察。
层析法使用HiTrap™ IEX Selection Kit, RESOURCE™ S和 RESOURCE Q柱分离病毒颗粒。选择根据ETC确定的pH值用于分离，将除盐的或稀释的病毒（在> 5 mS/cm时，适当的pH值) 用平衡好的层析柱分离。一般而言，在低强度缓冲液（缓冲液A，如适当pH值的25-50mM Tris)中平衡柱子，用1-3倍柱体积(CV)的病毒上样。
至少1-2倍CV洗柱，再以10倍CV缓冲液A和梯度到100%缓冲液B洗脱病毒，此处缓冲液B包含适当的盐分以确保病毒稳定，例如1M NaCl （需要考虑兼容性）。自始至终按照0.25-0.5CV收集组分。
根据病毒的传染性或利用Sepharose™6 Fast Flow(17-0159-01) 的Triccorn 5/10柱或MicroSpin™ S-400 HR Column (27-5140-01)分析收集的组分。用凝胶电泳分析收集的外水体积以确定病毒结合特性。
