鱼胶原蛋白粉中羟脯氨酸含量测定流程
实验流程
1.称取鱼胶原蛋白粉样品4g于平底烧瓶中,加入3mol/L硫酸溶液,用表面皿盖住(没有的用培养皿盖上也一样),放在105℃干燥箱内消解16h。
图一
2.趁热用圆形滤纸过滤到250ml容量瓶中,以10ml的3mol/L硫酸溶液分三次洗涤烧瓶和滤纸,合并于容量瓶中,以水定容。刚消解完的样品(过滤前)大约是深棕色,如图二:定容后会是浅黄色,如图三所示。
图二
图三
3.移取一定体积水解液(本例取0.2ml)于250ml容量瓶中,以水定容,摇匀。
4.吸取4.00ml样品溶液于25ml 比色管中,加入2ml氯胺T试剂,迅速混匀,放置20min。
5.再加入2ml显色剂于比色管中,这时会出现如图4所示乳白色的分层,这是正常现象,只要快速混匀,就会变成黄色的透明液体。然后用封口膜封住比色管。
图四
6.将比色管迅速放入60℃水浴中,加热20min中,取出后会变红,空白是黄色的,如图五所示:
图五
7.迅速冷却,与室温放置30min,558nm处测定吸收值,这个方法的标准曲线,线性还是不错的。
注意事项
1. 标准配置标准曲线取10.00ml,20.00ml,30.00ml,40.00ml标准储备液到100ml容量瓶,实际工作中取1.00 ml,2.00 ml,3.00 ml,4.00 ml到10ml就可以了,这样吸取和摇匀都方便。
2. 标准中水解液体积未明确给出,本例取0.2ml适用于羟脯氨酸含量8%-10%鱼胶原蛋白粉。如果样品实际含量不在此范围,需要自己选择合适体积,保证最终样品溶液含有羟脯氨酸浓度在0.5-2.0μg/ml。
3. 氯胺T试剂应该是白色的,称量时如果是黄色,说明试剂变质了。
4. 氯胺T试剂和显色剂配好后,至于棕色瓶中,避光,临用现配。
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