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免疫球蛋白纯化技术——Sepharose CL-4B亲和柱层析纯化IgG

2019.3.28

实验方法原理	葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
实验材料	SPA-Sepharose CL-4B
试剂、试剂盒	磷酸缓冲液 NaN3 枸椽酸缓冲液 Tris溶液再生缓冲液
仪器、耗材	玻璃柱
实验步骤	1. 用0.1 M PH8.0 磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15 min。按1 g干胶200 ml上述缓冲液充分洗涤凝胶（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤） 2. 装柱后用0.1 M PH8.0磷酸缓冲液平衡　　　　　　　　　　　 3. 标本可用硫酸铵粗提物，先10000 g离心除去杂质，必要时用0.22 μm滤膜过滤。上样前用1 M PH9.0 Tris液调整标本液PH至8.1或对平衡液透析过夜　　　　　　　　　　　 4. 加样，一般按25～30 mgIgG/g湿胶比例加样，室温作用15 min,0.1 M PH8.0磷酸缓冲液充分淋洗至淋洗液OD值为<0.02 5. 用不同PH的枸椽酸洗脱液洗脱，流速20 ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用PH6.0；纯化IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.1 M PH3.0醋酸盐缓冲液或0.1 M PH3.0 Glycine-HCl缓冲液洗脱　　　　　　　　　　　 6. 用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液　　　　　　　　　　　 7. 收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定展开
注意事项	1.　SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法：先用10倍柱体积0.1 M PH8.5 Tris含0.5 M NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1 MPH4.5醋酸钠缓冲液含0.5 M NaCl液洗脱柱上残存的杂蛋白；0.1 M PH8.0磷酸缓冲液平衡，4 ℃贮存。 2. SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法还可用于（1）除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；（2）除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；（3）回收或纯化免疫复合物。 3. 狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。展开