离子交换色谱（一）
实验方法原理
离子交换色谱是将离子交换基因（CM、SP、Q、DEAE等）键合于一定的惰性载体（纤维素、交联葡聚糖，交联琼脂糖等）之上，并以此作为固定相，依据样品所带电荷的不同，从而与固定相上的离子交换基团相互作用的程度不同而进行分离的一种色谱方法。离子交换色谱技术已广泛用于蛋白质、多肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖等的纯化。
离子交换剂是在载体上键合了一些离子交换基团，而离子交换基团在水溶液中通过电离释放出游离的离子，这些离子可带正电或带负电，可以被溶液中的其它带相同电荷的离子取代，并对离子交换剂有较强的结合力。结合力的大小不仅受离子与离子交换剂之间作用力的影响，而且主要受离子浓度的影响，这个过程中的作用力是静电引力，离子交换的原理是静电相互作用。
蛋白质在离子交换色谱上的保留时间取决于蛋白质在相应色谱条件下所带静电荷的多少，而蛋白质所带静电荷的多少是由蛋白质分子的pI和所处溶液环境的pH共同决定的。在酸性条件下，蛋白质带正电荷；在碱性条件下，蛋白质带负电荷。在阳离子交换柱上，只有pI大于流动相pH的蛋白质在柱子上保留，而pI小于或等于流动相pH的蛋白质不保留，即使它们的pI值彼此之间有差异，也都作为溶剂峰同时被直接冲洗出来。而被保留的蛋白质出峰顺序则是pI小的先出峰，pI大的后出峰。在阴离子交换柱上情况则恰恰相反。
离子交换色谱过程分为四个阶段：平衡-吸附-解吸附-再生，其中吸附和解吸附是主要阶段，现以纯化TNF过程中应用的Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF为例说明。
实验材料 TNF
试剂、试剂盒 Tris-HCl EDTAPB缓冲液硫酸铵透析液氯化钠
仪器、耗材 透析袋离心机离心管移液枪枪头阴离子交换基质Q-Sepharose FF蛋白检测仪阳离子柱SP-Sepharose FF试管
实验步骤
一、试剂的配制
1. 配制pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl含1mmol/L EDTA溶液（或其贮备液，临用时稀释即可）滤后使用。
2. 配制pH7.5 20 mmol/L的PB缓冲液，过滤后使用。
二、操作步骤
1. 样品的预处理
2. 样品的平衡
将实验一中50%饱水硫酸铵沉淀、离心得到的上清液，置于透析袋中，于20～40倍体积的pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA的缓冲液中，4℃搅拌透析24 h，中间换透析液3～4次，4℃ 12 000 rpm离心15 min，收集上清，测定蛋白浓度，记录体积。
3. 阴离子柱Q-Sepharose FF的平衡及上样
取阴离子交换基质Q-Sepharose FF装柱，柱体积5.4×20 cm用pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA 缓冲液流洗平衡层析柱，调整好蛋白检测仪的量程及记录仪灵敏度。将收集的上清液以8 ml/min流速上样。平衡缓液冲直至流出液吸光值恢复至基线。收集穿过峰，量体积，测蛋白含量。
4. 洗脱
洗脱液A为pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA缓冲液，洗脱液B为含终浓度为1 mol/L NaCl的A液进行线性梯度洗脱（根据纯化条件设定的纯化工艺），收集各洗脱峰量体积，测蛋白浓度，进行SDS-PAGE或进行活性鉴定TNF所在峰。
5. 将活性峰用pH7.5 20 mmol/L PB透析24 h，中间换液3次。离心，取上清并量其体积，测蛋白浓度。
6. 阳离子柱SP-Sepharose FF的平衡及上样
取阳离子交换基质SP-Sepharose FF装柱，柱体积2.5×10 cm，用pH7.5 20 mmol/L PB缓冲液流洗平衡层析柱，调整好蛋白检测仪的量程及记录仪的灵敏度，将透析、离心后的TNF的峰液以4 ml/min的流速上样，用平衡液洗至基线，收集穿过峰，量体积，测蛋白浓度。
7. 洗脱
阳离子层析柱SP-Sepharose FF的洗脱液A为pH7.5 20 mmol/L PB，洗脱液B为含1 mol/L NaCl的A液进行线性梯度洗脱，收集各洗脱峰，量体积，测蛋白质浓度，进行SDS-PAGE或活性鉴定。
8. 后处理
进行TNF的纯度、活性等鉴定，按要求分装加赋形剂冷冻干燥后制成一定效价的TNF产品。
