用Percoll不连续密度梯度法分离小鼠精原细胞的方法详解
精原细胞的生理生化特性及其分裂增殖、分化、运动、衰老、死亡等项生命活动的调节机制的深入研究，精子发生机理的进一步阐明以及精原细胞异体、异种移植技术的实际应用，都迫切需要找到一种可行的方法将其分离纯化，以期得到较高产量和纯度的有活力的精原细胞，用于体外培养。资料表明，从成年啮齿类的睾丸分离粗线期及其后各发育阶段生精细胞的工作已取得可喜成绩，所获细胞的纯度已超过90%，产量达到107个［1］。但可用于体外培养的精原细胞的分离却一直进展不大。有些报道虽然纯度很高，产量却很低；另一些报道产量高但纯度低。1977年，Bellve等［2］报道从生后8d小鼠睾丸中获得了纯度91%的A型精原细胞，产量达2×107个。但使用的小鼠却多达60余只，耗费了大量的实验动物。我们的前期工作已表明，小鼠生后7～8d，其生精上皮内基本只有支持细胞和A型精原细胞，其他各级生精细胞尚未发育形成［3］。在体外，支持细胞总是先生殖细胞而贴壁。因此，本实验选用生后7～8d小鼠的睾丸，事先排除其他生精细胞的污染，用组合酶消化获得细胞悬液，经Percoll不连续密度梯度离心，再用选择性贴壁法纯化，获得了较高纯度的精原细胞，基本满足了体外培养的需要。
材料和方法
1.实验动物
昆明小白鼠由本校实验动物中心提供，按常规方法饲养管理。参照文献［3］取7～8d小鼠用于细胞分离。
2.主要试剂
胶原酶IV(Sigma)，透明质酸酶(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，D-MEM(Gibco)，新生牛血清(NBS，Gibco)，Percoll(Pharmacia),胎牛血清(FBS，Gibco)。
3.细胞的分离
3.1 分离液的配制：按PBS∶Percoll=1∶9的比例把湿热灭菌后的Percoll原液配制成90%的Percoll溶液。用无钙、镁离子PBS，按表1所列方案配制Percoll各梯度溶液。
表1 Percoll密度梯度的浓度、组成及密度
Table 1 Concentration, components and
density of Percoll gradients
Percoll
浓度
(%)
concentra-
tion of
Percoll(%) 各梯度液
体积(ml)
volume of
Percoll
gradients
(ml) 90%
percoll
(ml) PBS
(ml) 1%双抗
(ml)
1% penicillin
and strepto-
mycin(ml) 各梯度密度
(1 000g/L)
density of
Percoll
gradients
(1 000g/L)
11 9 1.1 7.8 0.1 1.0214
19 9 1.9 7.0 0.1 1.0312
27 9 2.7 6.2 0.1 1.0410
35 9 3.5 5.4 0.1 1.0508
43 9 4.3 4.6 0.1 1.0606
3.2 细胞悬液的制备：取7～8d雄性小鼠5～6只，颈椎脱臼法处死。无菌收集两侧睾丸，置于盛有PBS的小皿中。整个睾丸收集过程在0.5h内完成。用尖镊子仔细去除每个睾丸的脂肪垫、附睾及睾丸白膜，加入适量PBS(1～2ml)，吸管用力吹打，将曲细精管吹散。加入相当于组织体积10倍的含1g/L胶原酶的PBS后入温箱，在37℃、5%CO2条件下作用15min(期间晃动数次)。之后移入5ml的离心管，轻缓吹打1～2次，静置待曲细精管段沉降后轻轻吸除上清，再重复上述过程1次。加入含1.5g/L透明质酸酶和0.25%胰蛋白酶的PBS后入温箱，同样条件下作用5～10min，倒置显微镜下见曲细精管段软散，有的已消散成单细胞或小的细胞团即可。加入含10%NBS、1%青、链霉素的新鲜D-MEM培养液终止消化，移入离心管中，1 000r/min离心3min或静置5min，待软散的曲细精管及已解离的精原细胞沉降后，轻轻吸去上清。重新加入1.5ml新鲜培养基(D-MEM+7.5%NBS+7.5%FBS+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%青、链霉素+1%丙酮酸钠)，吹打8～10次，制成单细胞悬液。
3.3 Percoll梯度的制备及离心：从已制备好的每级Percoll梯度液中各取1ml，按密度从大到小依次叠加到10ml离心管中。将待分离的细胞悬液置于梯度最上层，以1 400r/min离心20min［4］。
3.4 细胞的洗涤及计数：用吸管将各梯度中形成的细胞带小心取出，移至事先标记好的5ml离心管中，各加入1.5ml PBS稀释Percoll，以1 000r/min的速度离心3min,弃上清，重新加入1.5ml新鲜培养液吹起。取出1滴制备好的细胞悬液，加入10μl 0.4%台盼蓝混匀，用红细胞计数板计算活细胞、死细胞、细胞团的数目和细胞总数(没有吹散的由2个以上细胞连在一起的细胞团只记1次)，调整细胞密度至3×105个／ml。
3.5 细胞的接种和培养 参照文献［3］进行。
3.6 精原细胞的纯化及其纯度评估：分离细胞接种后，定时观察贴壁情况。当见到混杂其中的睾丸体细胞开始贴壁时，小心倾斜培养皿，将尚未贴壁的精原细胞连同培养液一起吸出，另行接种培养。待细胞贴壁后(大约培养12～24h)，弃去旧液，用PBS洗1～2次，加入新鲜培养液。任选3个视野，用计数器计每个视野中的细胞总数和精原细胞数(圆形的精原细胞附着在多突起的支持细胞上，呈链状、葡萄串状或以散在方式存在［3］)，然后分别计算均值±标准差(±s)。
4.电镜样品的制备
将新分离后位于27%～35% Percoll梯度间的细胞离心成团，弃去培养液，加入2ml 2.5%戊二醛，4℃下预固定24h；PBS清洗后转至1%的锇酸中后固定2h，逐级丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片机切片，JEM-1 200EX Ⅱ电镜观察(分布在19%～27%及35%～43%Percoll梯度间的细胞太少，没有制成电镜样品)。
5.统计学分析
表2用方差分析法(analysis of variance)、表4用χ2检验法(Chi-square test)对所得数据进行统计学处理。
表2 细胞在Percoll梯度中的分布
Table 2 Distribution of germ cells in Percoll gradients
试验次数
No. of
experiment 细胞总量×106
total number of
germ cells
(×106) Percoll梯度(Percoll gradients)
1带(×105)
band No.1
(×105) 2带(×105)
band No.2
(×105) 3带(×106)
band No.3
(×106) 4带(×105)
band No.4
(×105)
1 2.205 — 1.30a 1.32b 1.70a
2 2.025 — 3.90a 0.79b 2.30a
3 4.875 — 1.70a 2.70b 3.50a
4 6.000 — 2.50a 1.50b 3.20a
平均(average) 3.776 — 2.35a 1.58b 2.68a
注：同行肩注中不同字母表示差异极为显著(P<0.01)
In the same line, differences among numbers containing the different letters in the superscripts are highly significant(P<0.01).
结 果
1.生精上皮的消化
4次消化所获悬液量均为1.5ml。如表3所示，平均每10个睾丸可获得4.219×106个细胞；其中活细胞、死细胞、细胞团平均所占百分比依次为90.08%、9.92%和8.91%；平均每个睾丸可获得4.136×105个细胞。
2.生精上皮细胞在Percoll梯度中的分布
经Percoll密度梯度离心，细胞主要在相邻梯度的界面处形成细胞带。如表2所示，分布在11%～19%Percoll梯度间的主要是细胞间质、细胞碎片及少量死细胞，记为1带；分布在19%～27%percoll梯度间的细胞较少，平均密度为2.35×105个／ml，记为2带；分布在27%～35% Percoll梯度间的细胞最多，平均密度达1.58×106，记为3带；分布在35%～43% Percoll梯度间的细胞也较少，平均密度为2.68×105，记为4带。统计学分析显示，2、3、4带中细胞分布差异极显著(P<0.01)，其中3带与2、4带之间相比差异极为显著(P<0.01)，2、4带之间相比差异不显著(P>0.05)。
3.分离细胞的形态学鉴定
电镜观察显示，分离细胞圆形或卵圆形，胞质中除可见有少量具有板层状嵴的线粒体外其他细胞器不发达；核质比较大，核大呈圆形，常染色质细密均匀，异染色质少，呈块状附着于核膜内面或散在于核内。其形态结构特征与7～8d小鼠睾丸切片上的精原细胞完全一致(图1)。
4.精原细胞的分离纯度
1带中主要为死细胞及细胞碎片；2、4带中细胞接种后，大部分细胞延展后伸出突起，从形态学判定，主要为支持细胞及少量管周肌样细胞。主要收集3带中细胞，接种培养约3～4h，其中的支持细胞开始贴壁而精原细胞尚未贴壁(图2)，此时进行精原细胞的纯化；纯化细胞体外培养约7～8h后，绝大部分支持细胞已贴壁，大部分精原细胞开始贴壁(图3)，此时进行细胞计数。结果如表4所示，3带中精原细胞的纯度平均达到68.76%。
表3 组合酶消化法的效果
Table 3 The effects of digestion by combination of enzymes
试验次数
No. of
experiment 睾丸数(个)
number of testis 细胞总数×106
total number of
germ cells×106 死细胞数×105(%)
number of dead
cells×105(%) 活细胞数×106(%)
number of living
cells×106(%) 细胞团数×105(%)
number of cell
clumps×105(%) 细胞收获量／睾丸
×105 number of
cell／testis×105
1 8
2.415
2.10(8.70) 2.205(91.30) 2.25(9.32) 3.020
2 10 2.205 1.80(8.16) 2.025(91.84) 3.00(13.61) 2.205
3 12 5.625 7.50(13.33) 4.875(86.67) 4.35(7.73) 4.688
4 10 6.630 6.30(9.50) 6.000(90.50) 3.45(5.20) 6.630
平均(average) 10 4.219 4.43(9.92) 3.776(90.08) 3.26(8.91) 4.136
表4 3带中精原细胞的纯度
Table 4 Purity of spermatogonia in band No. 3
试验次数
No.of experiment 细胞总数
total number of cells 精原细胞数
number of spermatogonia 精原细胞所占百分比(%)
percentage of spermatogonia(%)
1
307.67±8.02
183±4.36
183±4.36／307.67±8.02(59.48)
2 724.67±11.50 446±25.63 446±25.63／724.67±11.50(61.55)
3 474.33±37.11 376±25.61 376±25.61／474.33±37.11(85.62)
平均 (average) 502.00±18.88 335±18.53 335±18.53／502.00±18.88(68.76)
讨 论
1.小鼠生殖细胞单细胞悬液制备的影响因素
良好单细胞悬液的制备必须首先考虑所用小鼠的日龄。因为随动物日龄的增加，精原细胞开始分化形成各级生殖细胞，其绝对数目及所占生殖细胞的比例都逐渐下降，会给分离纯化增加困难。在成年小鼠的睾丸中，A型精原细胞只占所有精原细胞的1.25%，占未分化精原细胞的10.6%，仅占所有生殖细胞的0.03%［5］。因而用来分离精原细胞的动物的日龄应较小为好。一般小鼠选用生后8d的［2］，但也有人选用生后10d的；大鼠则选用生后9d的［6］。根据我们的前期工作并参考有关报道［2，3］，7～8d小鼠的生精上皮内基本只有A型精原细胞和支持细胞，其他各级生精细胞尚未发育形成，理论上可获得最大量的精原细胞。
其次，采用适当的程序及消化方法也是制备良好单细胞悬液的关键环节之一。从小鼠体内取出睾丸之后，我们先用尖镊仔细去除脂肪垫及睾丸白膜，将曲细精管在PBS中吹散，尽量将间质吹打成单细胞及组织碎片。通过静置或低速离心，将其去除，获得较为纯粹的曲细精管段。然后采用两次较短时间的胶原酶消化，将没有消散的睾丸间质消散并释放大部分管周肌样细胞，最大程度地减少了间质组织及管周肌样细胞的污染。最后采用胰蛋白酶、EDTA复合消化液消化，释放支持细胞和精原细胞。实验结果表明，这种程序性的消化过程能有效地分离到较为纯粹的曲细精管段并制备出较高产量和活率的单细胞悬液，同时确保绝大部分间质成分，管周肌样细胞及睾丸外细胞的去除。
2.Percoll不连续密度梯度的分离效果
Percll是一种无毒，惰性，且与生物膜不发生粘附的物质。用它制成的梯度可在室温下放置数星期而梯度的形状不发生丝毫变化。Percoll密度梯度离心已被许多学者用来分离各种动物的精子［7］，而用于分离早期生精细胞的报道不多。Bucci等［8］用组合酶消化，Percoll等密度梯度离心分离了大鼠的A型精原细胞，所获细胞纯度达到51%。Hofmann等［5］用Percoll不连续密度梯度离心，从10d小鼠睾丸分离生殖细胞，结果精原细胞主要分布于密度为1.030的Pecoll梯度中。但文中没有报告所获细胞的纯度。
本实验结果表明，11%～19%Percoll梯度之间主要为死细胞及细胞碎片19%～27%及35%～43%Percoll梯度之间主要是大量支持细胞和少量管周肌样细胞。精原细胞主要分布于27%～35%Percoll梯度间。电镜观察表明，该带中大部分细胞的形态结构特征与相同日龄的小鼠睾丸切片上精原细胞的形态结构一致。该带细胞接种后，根据精原细胞与睾丸体细胞贴壁速度快慢的差异，利用选择性贴壁法，待睾丸体细胞开始贴壁极化而精原细胞仍然悬浮时(体外培养约3～4h)，将其进一步纯化后另行培养；待其贴壁后，依据其形态学特征进行计数，结果精原细胞的纯度平均达到68.76%，高于Bucci等的分离效果。本实验中，支持细胞在3个梯度中都有大量分布，可能与幼年鼠支持细胞非常丰富且其大小很不一致有关。
