用高速固定角转头不连续蔗糖梯度分离细胞器
在例（十）中已介绍了用日立CR22G/21G离心机R18A转头，日立50ml锥底组织培养管分离质膜的方法。下面介绍用一般的圆底离心管（瓶），不连续（阶梯）蔗糖梯度，在高速离心机上分离质膜、内质网、溶酶体、线粒体、过氧化酶体的方法。
设备：
●主机Hitachi，CR21GⅡ（或21G）高速冷冻离心机
●转头：R20A2固定角式转头8×50ml，Nmax＝20,000rpm，RCFmax＝48,000xg，顷角34。，Rmax ＝10.74cm，Rmin＝5.56cm
●离心管：50PA高速管，有PP压盖，标称容量50ml实际容量38ml或50PP离心瓶，有螺旋盖，实际容量34ml，或Nalgene 50PPCO离心瓶，实际容量40ml
离心参数：18,000rpm（39,120xg），4℃，5小时，加速“5”，减速“4”
分离步骤：
1. 样品以鼠肝为例，成年鼠肝匀浆，R20A2转头，4000rpm（约1900xg），4℃离心15分钟，加速“9”，减速“9”
2. 倒去上清，沉淀用1mM NaHCO3稀释，再次离心4000rpm，15分，4℃，加速“9”，减速“9”
3. 沉淀按湿重1g/ml，用1mM NaHCO3稀释
4. 将（3）与40％w/w蔗糖液混合成样品液
5. 根据离心管（瓶）的实际容量分成5等分，按每等分容量分别自上而下在离心管（瓶）中配置10％，28％，30％，40％w/w蔗糖液，底部是等容量的样品液
6. 离心：18,000rpm（39,120xg），4℃，加速：“5”，减速“4”，5小时
7. 结果：
●质膜分布在蔗糖梯度10％--28％界面之间
●内质网分布在蔗糖梯度28％--33％界面之间
●溶酶体分布在蔗糖梯度33％--38％界面之间
●线粒体及过氧化酶体分布在离心瓶（管）近底部蔗糖梯度45％附近
讨论：
1. 经过长时间离心，由于浓度扩散，初始阶梯梯度已变成了非线性分段连续梯度，已不存在蔗糖在某一点的浓度突变
2. 梯度取出：可用手工分层取出（每个离心管收集成50—100管，分别测试OD，并绘出OD（纵坐标）→管数（横坐标）曲线可以看出每种亚细胞构造的OD峰
或用日立DGF—U密度梯度自动制备和收集仪连续收集，DGF—U出液管直接连接到分光光度计流动池连续测OD后并在记录仪上绘出OD—容量曲线后用自动分部收集器收集成100管。根据OD峰位置判定各种亚细胞构造所在的收集管。
3. 收集的较纯亚细胞构造还可以进一步用线性连续蔗糖梯度分离和纯化。
4. 以上方法分离产物主要是大片（如质膜），大颗粒（如重线粒体）的亚细胞构造，如果要分离更分丰富的亚细胞构造，可将本文分离步骤改为（1）肝匀浆，1000xg×10分钟，留上清，沉淀稀释后在1000xg×10分钟，再留上清，（2）二次上清合并后，用上述转头18,000rpm×2.5小时，4℃，加速“9”，减速“9”，取沉淀继续运用上述分离步骤
（从3到7）
