BioTNT PCR Array实验操作（一）

2020.6.08

一．用户需要自备的材料和仪器

^{Biotnt First Strand cDNA Synthesis Kit：A2010B0B03 ；}

^{Biotnt qPCR Premix Kit： A2010A0112；}

^{RNA 抽提：推荐使用Qiagen RNeasy Mini Kit (50) 74104，RNase-Free DNase Set (50)，79254}

^{DNase/RNase free枪头，PCR反应管，1.5 mL离心管}

^{10 μL到1,000 μL可调节单通道微量移液器以及适配的枪头}

^{5 μL到20 μL可调节多通道微量移液器以及适配的一次性枪头}

^{定量qPCR仪器}

^{384 微孔板排列（24*16）：每块板分为四个区，不同区内可以加入不同的样本；}

二．实验步骤：

2.1 实验前准备

^{注意事项：}

^{1. 开始实验前请仔细阅读产品使用手册。注意：请确认qPCR array 与您的qPCR仪器匹配；}

^{2. 严格按照QPCR标准步骤操作，采用以上推荐试剂盒进行抽提mRNA，注意去除基因组污染；避免核酸污染和非特异性扩增。}

^{RNA 定量与质量控制}

^{A. 使用无菌水(RNase-free)稀释 RNA 样本，检测 260 nm 和 280 nm 吸光值，A260/280 应大于 1.8。}

^{B. 使用公式A260× 40 ×稀释倍数 = XXXXμg/mL 计算 RNA 浓度。}

^{C. 使用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。}

^{D. 建议：RNA 质量测定后，逆转录得到CDNA，建议用多个内参基因自行验证CDNA 质量；}

^{3. 基因组DNA污染控制}

^{每个Array板块上的GDC(Genomic DNA
Control)反应孔专为检测每个样品进行qPCR反应时可能存在的基因组DNA污染而设置。如果该反应孔的CT值小于35，则表明存在可检测到的基因组DNA污染，应采取措施予以解决。因此，必须从RNA样品中去除基因组和其他全部残余污染物。建议采用Qiagen
柱式抽提过程中加入DNAse去除基因组污染。}

^{4. RNA 含量调平：实验样本的RNA 尽量调到同一水平；加入RNA 酶free的水，调整RNA 浓度；}

^{预计每个样本需要的 RNA 量和RT-PCR反应数(逆转录CDNA；采用逆转录试剂盒进行，每个样本准备100ul的CDNA)；}

2.2 PCR-Array 实验步骤：

^{1．从-20度冰箱拿出PCR Array，平衡到室温后拆开自封袋，取出PCR Array的384板；}

^{2．融解并充分混匀BioTNT QPCR 染料法premix，短暂离心使管中试剂处于底部，冰上保存。（一块384板需要使用4.4 ml premix）；}

^{3．去除积存在封闭反应板表面的冷凝物。小心撕去板上的密封膜。}

^{4．样本加样，进行QPCR 实验；配制过程在冰上操作。}

^{qPCR array 可对同一样本中多个基因同时进行检测，为了充分满足实验需要以及避免实验操作产生的损耗，在配制qPCR反应液时需要比实际体积多出 10%。}

^{充分混匀qPCR反应液，短暂离心。每个反应孔精确加入 20 μl 反应液。每次加样都需要换用新的枪头以避免交叉污染。}

^{准备PCR 混合物：样本1准备100ul CDNA，加入1ml PCR 水和1ml premix（采用BioTNT premix，货号：A2010A0112），混合。}

^{区一有96孔，样本一的混合物每孔加入混合物20ul；}

^{同理，样本2的混合物加入区二的96孔中，每孔加入混合物20ul；}