浅谈荧光在酶标仪上的应用以及新一代酶标检测系统...一
浅谈荧光在酶标仪上的应用以及新一代酶标检测系统（Paradigm+Tune）的优势
前言
我们知道目前生命科学及现代分子生物学主要集中在对核酸和蛋白质等生物大分子的分析以及进行一些细胞水平的研究。传统的分析方法是采用放射性同位素作为一种示踪剂，标记在各种生物大分子或者细胞中来研究它们之间的相互作用和变化，但是放射性同位素对环境具有一定的破坏性，对人体健康也具有一定的损害，所以各国的科学家都致力于研究和应用高灵敏度的非同位素检测方法，利用荧光探针作为一种标记物，以其自身的一些优势而得到广泛的应用。目前对荧光进行检测的仪器种类很多，例如我们常见的荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、多功能读板仪（酶标仪）等，普通的荧光显微镜只能观察物质形态，不能给出量化指标，而流式细胞仪又因其价格昂贵和操作复杂不能得到广泛的应用。酶标仪作为一种荧光信号检测仪器，具有很多优势，不但价钱便宜、个头小、操作简便，而且还可以根据荧光信号特点和强弱来对物质进行定性和定量的分析。目前市面上支持荧光检测的多功能酶标仪种类很多，例如Molecular Devices的SpectraMax系列的M2，M3，M4和M5，和目前市面上唯一一款可以完成快速动力学实验的Flexstation 3等。
荧光产生机理
荧光探针（荧光染料分子）在光的照射下，物质的电子吸收能量后，可由低能级的电子层（内电子层）跳到高能级的电子层。此时，电子由低能态进入高能态。高能态的电子是不稳定的，他会在极短的时间（10-8s）内，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的能态。这时发射出的波长比激发光的波长要长，如果在可见光波长的范围内，为人眼所能看见的光，这种光称之为荧光。荧光是发光体分子中处于激发态的原子核外电子由高能级回到低能级所产生的辐射，因此是冷光。荧光的颜色多为蓝色、绿色、红色和黄色等。
荧光检测技术优势和影响因素
荧光检测技术具有灵敏度高、特异性好、动态范围宽、无放射性污染等优点；但也易受到反应体系中PH值和环境温度的影响，另外如荧光淬灭、光漂白等现象也会对荧光信号的检测产生较大的影响。
我们可以根据荧光探针分子特性（半衰期不同）将荧光检测技术分为荧光强度（FI）和时间分辨荧光（TRF）两大类。
荧光强度（FI）
荧光强度即发射荧光的光量子数，荧光强度决定了荧光色素检测的灵敏度。利用荧光强度进行物质定性：即不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。也可进行物质的定量测定：利用在较低浓度下荧光强度与样品浓度成正比这一关系可以定量分析样品中荧光组分的含量。荧光强度检测技术在生物学上的应用非常广泛，可以进行生物大分子定量、酶活性分析、荧光免疫分析、细胞学分析（细胞增殖、细胞毒理、细胞吸附等）、胞内钙离子浓度的变化、荧光蛋白的报道基因分析 (GFP)、细胞凋亡等。
细胞增殖检测
目前细胞增殖检测普遍采用MTT方法，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，DMSO溶解后，酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，此法可间接反映活细胞数量。但是其步骤比较繁琐，且MTT对人有致癌性。所以荧光检测方法以其自身许多优点越来越得到大家青睐，以（Invitrogen）CyQuant细胞增殖检测试剂盒为例,其为一种绿色荧光探针，能与细胞裂解液中的核酸特异结合,其检测灵敏度可达50cell-50000cell/200ul，整个反应过程是免洗的，适合高通量实验，并且不易受到细胞培养液中血清等成分干扰。
细胞内钙流检测
钙离子是机体的重要元素，作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、钙调蛋白激酶等）及诸多蛋白水解酶和核酸酶，从而参与包括细胞代谢、细胞周期等多种细胞功能的调节，在细胞的许多生命活动中担当着重要的角色。传统的 Fura-2，indo-1，Quin-2是Ca2+荧光指示剂，可以反映细胞内钙离子浓度的变化，当结合钙离子时，最大激发波长会发生改变，发射荧光的强度和结合的Ca2+浓度有着定量的关系，但是这些钙流检测试剂有其自身一些缺点，首先整个反应过程需要水洗，不适合高通量实验要求，其二对温度敏感，光稳定性差。Molecular Devices针对于钙流检测特点推出了一系列检测试剂盒，首先采用ZL的quanch技术，整个反应过程不需要水洗，增加检测通量，其次采用特殊的荧光探针，与钙离子结合后其稳定性较好，荧光信号强等优点得到很多实验者的肯定。
