蛋白质免疫印迹技术
实验概要
免疫印迹是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测样品或提取物中某种特定蛋白的方法。聚丙烯酰胺凝胶紧贴着膜放置，在电流的作用下蛋白质从凝胶迁移到膜上并且被固定，常用的膜是硝酸纤维素或 PVDF（聚偏乙烯氟化物）。膜是凝胶蛋白质的复制品，然后可以与抗体结合后进行染色。
实验步骤
1. 样品准备
1) 抽提缓冲液
准备凝胶电泳的样品，需要对细胞和组织进行抽提以释放目标蛋白，这些可溶性蛋白能够穿过分离胶单独移动。抽提缓冲液有很多种，但用来做 WB 试验的仅有少数几种。简单来说，它们溶解蛋白的能力不同，含有十二烷基硫酸钠和其他离子型去污剂的溶解能力最强。
但部分 Abcam 抗体能够识别降解和变性蛋白质，因此应该在还原和变性条件下使用该类抗体。需要注意的是一些抗体只能识别天然的、非变性的蛋白质，故不能识别经去污剂（SDS、脱氧胆酸盐、弱降解作用的 Triton X-100 和 NP-40）作用的蛋白质。
选择抽提缓冲液首先要考虑选择的抗体是否识别变性的样品。如果不能，有关资料会列在抗体说明书上，应该使用不含去污剂的缓冲液或者是相对温和的非离子型缓冲液（NP-40，Triton X-100）。
2) 蛋白酶和磷酸酶抑制剂
一旦裂解发生，水解、去磷酸化和变性就开始了。如果样本一直保存在冰上或 4 °C，并且一开始就往抽提液中加入适当抑制剂的话，这些反应将可以大大减缓。
混合（鸡尾酒）的蛋白酶和磷酸酶抑制剂已经商品化，您也可以自己研制抑制剂的配比。
3) 细胞培养物的裂解准备
a. 用双蒸水溶解原钒酸钠至 100 mM。
b. 用盐酸调 pH 值至 9.0。
c. 加热至无色。为尽量减少由于蒸发所致体积减小，加热时加盖。
d. 冷却至室温。
e. 调 pH 值至 9.0。
f. 再次加热至无色。
g. 再次加热冷却重复以上循环直至加热冷却后溶液 pH 值保持在 9.0。
h. 用水补至起始体积
i. -20 °C 分装保存，若变黄则废弃。
4) 组织抽提准备
a. 将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
b. 吸干 PBS 后，再加入冰冷的裂解液（每 107 cells/100 mm2 培养皿/150 cm2培养瓶加 1 ml，0.5 ml 每 5 x 106 cells/60 mm2培养皿或 75 cm2培养瓶加 1 ml）。
c. 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。
d. 4 °C 持续振荡 30 分钟。
e. 4 °C 预冷微型离心机中 16000g 离心 20 分钟。
f. 从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀。
5) 蛋白质含量的测定
用 Bradford、Lowry 或 BCA 方法测定蛋白质含量，牛血清白蛋白是常用的蛋白标准。
一旦确定了每管的蛋白浓度，就可以在 -20 °C 或 -80 °C 冷冻样品备用，或为免疫沉淀反应或凝胶上样做准备.
6) 凝胶上样准备
抗体特异性识别目的蛋白的部位（即抗原表位）可能存在于蛋白的三维构型内部。为了能使抗体接近抗原表位，必须将蛋白的三维构型打开，即变性。
要使蛋白质变性，使用含阴离子变性去污剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的上样缓冲液，95-100 °C 煮沸 5 分钟。或者在 70 °C 加热 5-10 分钟，尤其是研究跨膜蛋白时，因为煮沸更易形成聚集物，而聚集物不能有效的进入胶中。
标准品上样缓冲液称做 2 倍 Laemmli 缓冲液，最初描述在《自然》杂志上（1970 Aug 15; 227(5259):680 -5.）。也可以用 4 倍和 6 倍的样品缓冲液，可以减少缓冲液对样品的稀释。2 倍的样品缓冲液和样品以 1:1 的比例混合。
使用 SDS，通过 SDS 阴离子的粘附作用，所有的蛋白质都带负电荷，SDS 通过“缠绕”多肽链使蛋白变性。SDS 以 1.4:1 的比例结合到蛋白上，SDS 赋予多肽的负电荷数与蛋白的长度成比例，即变性的多肽成为负电荷云的“标”，每一单位长度的多肽带有相同的电荷数或电荷云密度。
在变性 SDS-PAGE 中，迁移率不是由多肽固有的电荷数目来决定，而是由多肽的分子量来决定。SDS 的纯度尤为重要，低纯度的或放置时间较长的 SDS 可引致不明显的蛋白条带和高背景。
使用 SDS，通过加入 β 巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT)，在蛋白形成自由弯曲之前减少二硫键的形成是非常必要的，使蛋白可按分子量大小来分离。
上样缓冲液中加入甘油能增加样品的密度，使样品停留在样品池的底部，防止外溢和使凝胶上样不规则。
为了能看到蛋白的迁移，通常在上样缓冲液中加入小分子的离子型染料（如溴酚蓝）。染料在混合物中的迁移速度最快，能够提供一个迁移前沿来监测分离的过程。
蛋白质样品处理时，加热前后都要用漩涡振荡器彻底混匀样品，使溶解彻底。
2. 电泳
1) PAGE 凝胶准备
聚丙烯酰胺凝胶电泳, 英文简称是 SDS-PAGE (for Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Eletrophoresis)，是根据蛋白质分子量来分离蛋白质的基本方法。
聚丙烯酰胺凝胶由两种化合物聚合而成，丙烯酰胺和 N,N-亚甲基丙烯酰胺（缩写为 Bis）。Bis 是凝胶的交联剂。通过加入过硫酸铵和 DMAP 或 TEMED 启动交联聚合作用。凝胶为中性、水溶性三维网状结构。（通过亚甲基交联的碳氢化合物）。
分子在凝胶中的分离取决于凝胶内部所形成的孔径大小。凝胶孔径的大小由两个因素决定：丙烯酰胺的总量（表示为 %T）和交联度 (%C)，当丙烯酰胺的百分含量升高，孔径减小。5%C 时孔径最小。C% 增加或减少，孔径也随之增大或减少。凝胶的百分比浓度组成有二个重要的参数。总丙烯酰胺指的是丙烯酰胺占 bis-丙烯酰胺总量的百分比浓度 (w/v)。例如，7.5%T 表示 100ml 凝胶中有 7.5 g 丙烯酰胺和 bis。
2) 阳性对照
阳性对照抽提物用来检验实验体系的有效性和正确性，及可证明目标蛋白不在样本中表达。
3) 分子量 marker
样品旁边的分子量标准能标示蛋白分子量的大小并能监测电泳的过程。有许多市售分子量标准可供选择。
4) 上样和跑胶
使用特定的凝胶上样吸头或微型注射器在狭窄的样品池中加入全部样品，注意不要用尖头刺破池的底部，否则会形成扭曲的条带。不要过度填充样品池，如果样品溢入旁边的样品池，将会影响结果。每个样品池装载 20-40 μg 蛋白。将凝胶浸泡在电泳缓冲液中，除了天然的凝胶电泳缓冲液外通常包含 SDS。
一个标准的 PAGE 电泳缓冲液，又叫运行 (running) 缓冲液，是 1 × 氨基乙酸-甘氨酸。凝胶电泳时按照厂家推荐的时间进行，这些可以随着仪器的改变而改变（根据电压，1 小时至过夜）。当染料分子（迁移前沿）到达凝胶的底部，关闭电源。此时蛋白会从凝胶上慢慢的洗脱，不要保存在凝胶里，因此要迅速进行下一步的转移操作。
5) 使用对照
内参是用来检测所有的电泳道载有相同样本量。在比较不同样品的蛋白表达水平时这一点尤其重要。这对检查整个凝胶的平均转膜非常重要。如有上样或转膜不平均的情况，内参对照用来定量每条泳道的蛋白量。
3. 蛋白质的转移和染色
1) 蛋白在凝胶中的显色
此阶段的蛋白显色非常重要，可以知道蛋白迁移的是否均匀、平坦。如果分离后的蛋白需要转膜，就用铜染，因为考马斯蓝染色是不可逆的。转移后用考马斯蓝染色检测转移的有效性，或者不需要转膜仅仅观察蛋白 SDS-PAGE 分离的结果时用考马斯亮蓝染色。
2) 转移
a. 详细的转膜操作可以在电转仪厂家的网页上找到，不同的系统操作也有区别。蛋白从凝胶至膜的转移应用的原理是电荷在电场中的迁移。
b. 转膜方式分为半干转移和湿转移两种，半干式转膜速度比较快，而湿式转膜不会因为膜的干燥而失败，因此成功率高并特别适合分子量大于 100 kDa 的蛋白。两种转膜方式都是膜紧贴凝胶，位于两层吸收材料之间，固体夹板夹在外面以保证膜和凝胶的紧密接触。
c. 湿式转膜中膜和凝胶的三明治结构位于滤纸和海绵体之间（海绵/纸/胶/膜/纸/海绵），全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡。整个三明治结构浸泡在转移缓冲液中，然后施加电场。带负电荷的蛋白向阳极移动。但膜阻挡了它们，并与其进行结合，从而阻止了它们的继续移动。凝胶一般在 100V 条件下运行 1~2 小时，但时间和电压需要优化，我们推荐根据厂家的说明进行操作。
d. 标准的湿转缓冲液和电泳缓冲液一样，为不含 SDS 的 1X Tris-gly 缓冲液，加入终浓度 20% 甲醇。如果转膜的蛋白分子量大于 80 kDa，则推荐加入 SDS 使之终浓度为 0.1%。
e. 半干式转膜中，三明治结构纸/凝胶/膜/纸用转移缓冲液浸湿，直接置于电转仪的正负极之间。在进行转移时，要注意一定要使膜紧贴阳极而胶紧贴阴极。电转缓冲液中 Tris 和甘氨酸的比例不必和湿转的相同，参考厂家的仪器说明书。标准配方是：48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。
f. 两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和 PVDF 膜（带正电荷的尼龙膜）。PVDF 膜需要小心地进行前处理：剪出大小合适的膜，在甲醇中浸泡 1-2 分钟，再于冰冷的电转缓冲液中孵育 5 分钟。胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分钟，否则转膜时起皱导致条带变形。
3) 蛋白在膜上的显色：丽春红
为检测转膜是否成功，用 TBST 溶液洗膜（TBST 溶液的配制详见 77 页缓冲液章节）。准备贮备液：2% 丽春红 S 溶于 30% 三氯乙酸和30% 磺基水杨酸，室温条件下震摇 5 分钟。1:10 稀释贮备液。
然后将膜浸泡在水中直至水变清且蛋白条带清晰。
用 TBST 溶液或水重复洗膜直至膜完全脱色，PVDF 膜需再用甲醇活化然后用 TBST 溶液洗。
4) 膜封闭
有两种传统封闭液：脱脂奶粉或 BSA（Cohn 因子 V），脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景）。为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合，需要进行膜的封闭。
某些抗体用 BSA 封闭时可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，参考数据表的说明，以确定有无关于如何封闭膜的特殊指导。
用封闭缓冲液封闭 1 小时，4 °C 震摇，封闭后用 TBST 溶液洗 5 秒
5) 加一抗孵育
孵育缓冲液：按抗体说明书建议的稀释倍数，用 TBST 溶液稀释一抗。如果说明书没有建议稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000) 进行预试验，然后根据试验结果选择合适稀释倍数，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。
某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的 TBST 来孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果不同。
孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过 18 小时）不等，具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。
孵育温度：如果在封闭液中孵育过夜，应在 4 °C 进行。否则污染会导致蛋白降解（特别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆盖膜，防止结合不均匀。
6) 加二抗孵育
一抗孵育结束后，用 TBST 摇动洗膜数次，每次 5 分钟或更长，去除残留的一抗。
孵育缓冲液和稀释：按说明书推荐的倍数用 TBST 稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释 (1:1000-1:20,000) 预实验，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。
可以在封闭液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景的同时导致特异性条带的信号也减弱，可能是封闭剂阻碍了抗体与目标蛋白的结合。
孵育时间和温度：室温振荡 1-2 小时。
标记物：推荐使用 HRP 标记二抗，不建议使用 ALP（碱性磷酸酶）标记二抗，因其不够灵敏
7) 检测方法
检测试剂盒：
HRP 标记二抗：常规应用 ECL 和 ECL （自制或购买），推荐使用后者。对于新一代检测仪器例如 Genegnome，请用仪器制造商推荐的试剂盒。
我们不推荐 ECL 或 BCIP/NBT 试剂盒，因为不够灵敏。
X-ray 胶片：
通常采用手工曝光的方法，可控制 X-ray 胶片在曝光剂和定影剂的时间。而全自动 X-ray 胶片曝光器也已经广泛使用且操作简便。
数字图像显影：
新一代的胶片显色方法是使用数码相机在暗室中拍摄膜上的化学发光，将其转成数字信号，再通过仪器自带的软件进行分析。
已有市售的数字成像仪。新一代数字成像仪不使用 HRP 标记抗体（即化学发光），如 STORM 分析仪只检测荧光标记二抗，Odyssey 红外线成像系统则只能检测红外线荧光。
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