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RNA的提取和cDNA合成（酸-苯酚法）

2020.9.07

内容提要
利用酸-苯酚法提取植物叶片中的RNA，并对其进行纯化，最后利用反转录酶得到相应的cDNA，可用于以后的分子生物学操作。
本实验要求：
1、掌握酸-苯酚法提取RNA的方法。
2、了解RNA操作中的重要性。
原理
从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA 的第一链和第二链，将双链cDNA 和载体连接,然后转化扩增，即可获得cDNA 文库,构建的cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析；比较cDNA 和相应基因组DNA 序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。
一、主要仪器、材料、和试剂
1. 仪器
恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，生化培养箱，电泳仪，超净工作台，移液器。

2. 材料
植物叶片
3. 试剂
⑴ RNA提取液储液：
25g异硫氰酸胍，29.3mL灭菌重蒸水，1.76mL0.75M柠檬酸三钠，于65℃溶解后，加入2.64mL 10% Sarcosyl（10% Lauroyl sarcosin：在65℃下，用90mL的灭菌重蒸水溶解10g Sarcosyl，pH 6.7）
⑵ RNA提取液：10mL 提取液储液+72mL b-巯基乙醇，现用现配。
⑶ AMV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工。
二、操作步骤
1．叶片总RNA的提取和纯化
根据Chomeyrshi，Sacchi和Logemann ( 1987 )的酸-苯酚法略作修改。
① 将200-400毫克处理的半叶状体转移到经液氮预冷冻的研钵中，加液氮充分研磨，再加入2mL提取液（提取液成分见后），然后转移至7mL离心管中，并加入200mL 2 M的醋酸钠（pH4.0）, 振荡混匀；
② 加入2mL水饱和酚（含0.1% 8-羟基喹啉）和400mL氯仿：异戊醇（V:V = 49:1）, 振荡抽提，冰浴20－30分钟；
③ 18,000g在4℃下离心20分钟，取上清液，加入等体积的异丙醇，-18℃放置1小时以上；
④ 在4℃下18,000g离心20分钟，弃上清，用3M醋酸钠（pH5.2, DEPC-H2O配制），轻洗沉淀，然后在室温下以18,000g离心6分钟, 弃上清；
⑤ 重复步骤（4）一到两次;
⑥ 用75%乙醇（DEPC-H2O配制）洗沉淀，室温下以18,000g离心6分钟，彻底挥发除去乙醇;
⑦ 用30-50mL DEPC-H2O溶解核酸沉淀，得到初步提纯的RNA样品。测出核酸样品在280nm、260nm、230nm的光吸收值，计算A260nm/A280nm、A260/A230nm的值，以分析所提核酸样品的质量和浓度。
2. RNA样品中DNA的去除，用DNase I来消化，反应体系及程序如下：
①100mL反应体系中含有；
1 mg/mL RNA sample 60 mL
DEPC-H2O 28 mL
10´Buffer 10 mL
DNase I (5u/mL) 2 mL
混匀以后，37℃温育30分钟
② 加入80mL水饱和酚和25mL氯仿，充分振荡，冰浴15分钟;
③ 在室温下以20,000 g离心6分钟，取出上相（水相），加入1/9体积的3M醋酸钠（pH 5.2）, 混匀后，再加入2倍体积的冷无水乙醇，-18℃下放置2小时以上;
④ 20,000 g离心9分钟，弃上清，用75% 乙醇轻洗沉淀，并在真空中彻底挥发除去乙醇;
⑤ 把得到的RNA样品溶于适量的DEPC-H2O中，测样品的OD值，计算出所提RNA样品的总量和浓度。
3. cDNA的合成