Ampha Z32阻抗流式细胞仪在小麦孢子发育及产胚量早期预...
Ampha Z32阻抗流式细胞仪在小麦孢子发育及产胚量早期预测中的应用
单倍体育种作为育种的核心生物技术之一，具有快速纯合基因、缩短育种年限、提高育种效率等优势。这项技术是基于对处于发育特定阶段的小孢子在进行胁迫处理，可使小孢子的配子体途径发生重编程转向孢子体途径，从而产生胚胎。在整个发育过程中，雄配子体诱导的产胚率受许多因素的影响，如供体植株的质量和生理状态、自身基因型、小孢子发育阶段、胁迫诱导预处理和培养条件等，因此如何提高雄配子体诱导的产胚率是这项技术成功的关键。
在过去十年中，研究者通常利用染色法和显微镜镜检来研究小孢子胚性发育并进行产胚量的预测，由于染色法不具备通用性，不同的物种需要选择不同的染色剂，导致整个测试过程繁琐且费时、耗力。因此，亟需一种可以简单、快速、可靠检测小孢子胚性发育阶段的无创检测工具。有研究报道，Ampha
Z32阻抗流式细胞仪（IFC）基于细胞介电特性可检测细胞的大小及活性，已应用于细菌活性、酵母大小，肿瘤细胞的分化、凋亡和坏死等多项研究中。
本研究利用Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC），进行了：（i）离体培养细胞活力的常规监测；（ii）胁迫处理效率的测定；（iii）小孢子悬浮液中产胚量的早期预测，探讨了小麦小孢子离体培养过程中发生不同发育途径的可能性。研究表明，IFC技术可以很好的描述细胞悬浮液中所有小孢子的发育途径，包括胚性小孢子和花粉小孢子，可以简单快速准确的评估胁迫处理的效率，并在小麦雄核发育的早期（离体培养的前7天内）进行产胚量的可靠预测。
图1 IFC法判别小孢子悬浮液（培养1天）中活细胞和死细胞
（A）为热处理后小孢子悬浮液散点图；（B）为未处理小孢子悬浮液散点图；振幅代表细胞大小，相位角代表细胞活性；（C）为IFC法与染色法相关性比较（P＜5；=0.9922，n=15）
图2 Pavon小麦配子体和孢子体途径的发育阶段（IFC法）
配子体途径：ML：单核中晚期；EB：早期双核；LB：单核晚期；ET：三核早期；LT：三核晚期。孢子体途径：显示了培养前21天、培养第0、1、5和7天的小孢子发育状态。ML/D-21代表配子体发育和孢子体发育的共同阶段，红色垂直门控右侧为活性细胞，蓝色多边形门控P1为雄核发育开始时的活性孢子群；绿色多边形门控P2为孢子离体培养前（D0）的活性孢子群；紫色多边形门控P3为离体培养1天后的活性孢子群。P1、P2、P3三个孢子群精准描绘出雄核发育过程的三个阶段。
图3 Pavon小麦配子体和孢子体途径的发育阶段（显微镜）
荧光DAPI染色后，使用可见光显微镜观察小孢子：（A）单核小孢子；（B）双核小孢子；（C）花粉粒；（D）星形小孢子（v为液泡）；（E）多核小孢子；（F）质膜化小孢子。比例尺＝20μm。
图4 P1、P2、P3三个小孢子类群的振幅和相位角中值数
本次实验分别在培养前21天、培养第0天和第5天用IFC法检测了不少于5个小孢子悬浮液，并分别分析了每个悬浮液中P1、P2和P3类群中小孢子的活性（振幅A图）和大小（相位角B图）。每个点代表每个类群内小孢子的数量。Tukey检验表明，不同培养天数下，不同类群内的孢子数量没有显著变化（p<0.05），进而说明IFC法可以精准描绘出雄核发育过程。
图5 雄核发育过程中小孢子活力的变化
图6 IFC法与显微镜镜检结果的比较
图7 Pavon小麦小孢子培养早期的产胚量预测（IFC法）
本实验利用培养第7天的小孢子悬浮液中P3类群的小孢子的存活率并与产胚量进行了相关性分析，所得线性方程为：y=6.539x-20.827；=0.9519，p<0.05 。结果表明，IFC法可以在小孢子培养早期进行产胚量的准确预测。
综上所述，Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC）是一个能够简单快速追踪小孢子的发育状态、评价胁迫处理效率、进行产胚量早期预测的可靠测量工具。
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