活体电穿孔法介绍（二）
电 压
电穿孔时在能量导入一定的情况下设计施加电压的值。电压过低或过高都会影响外源基因的表达。电压过低时,无法造成细胞膜表面状态的改变,因而外源D不能进入细胞内。电压过高时,局部组织积聚过多热量,造成细胞的死亡或组织失去功能,即使外源基因导入细胞,也无法进行正常的表达。哺乳动物常用的活体电压大多为20～100VPcm
,最高电压在250～750VPcm。
电穿孔次数和时间
有试验证明,皮肤的电阻在每一次电穿孔后都有所降低，说明电穿孔使皮下组织形成孔道,且其大小随电穿孔而变大,经过电穿孔的处理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊内表达。但电穿孔次数不能过多,否则会对局部的细胞组织造成不可逆的损害,基本应在10
次以内,每组电穿孔时间应在20～100msec 。
能量的测算
电穿孔过程中能量的测算公式为: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表电穿孔时导入的能量,V 代表施加的电压,T
代表电穿孔延续的时间,R
代表作用组织的电阻。试验证明在导入能量一定的情况下外源基因转移效率也相近。在此原则基础上可根据不同的组织器官选择不同的电压和电穿孔时间。
温 度
由于电穿孔瞬间在局部会产生大量热,因此操作过程中,DNA 转染试剂应保持4 ℃,同时电穿孔操作部位的温度也应适当降低,Muramatsu
证明温度较低的情况下,外源基因的转移表达效率会有明显的提高。此外在电穿孔操作部位温度降低的同时可以有效抑制局部组织的出血和外源DNA
的流失,这样也在一定程度上保证了基因的导入效率。
DNA 的状态和浓度很多试验都证明线状DNA 较环状DNA 在活体电穿孔法瞬时表达系统的建立中效果较好[12 ] 。DNA
的浓度应在1～40mgPml 范围内。DNA
溶液组分DNA溶液中不应含有不能分解成离子的组分,如甘露糖醇、蔗糖等。这些大分子存在时会降低基因的转移效率。
5、活体电穿孔法在不同组织上的应用
肌肉组织
在肌肉组织中最初进行外源基因活体导入是采用电穿孔法。选择肌肉组织作为靶组织是因为肌肉组织在体内所占比例很大,约占40 % ,而且外源基因可在肌肉中长期表达、分泌,在基因治疗中经常会用到。此外,外源基因也不会因肌细胞的分裂而丢失。
皮 肤
皮肤组织相对于其他组织较难进行电穿孔法的基因导入,因为皮肤比较薄,电阻相对低,要求电流较高。但如果电流过大,会严重影响基因的表达,因此应适当降低电流和电压,延长电穿孔的时间。另外,由于皮肤组织含有的脂肪细胞分布不均,会干扰电穿孔的作用,因此只推荐用镊状电极,且应将动物被毛刮净后操作。虽然外源基因在皮肤中表达的时间较肌肉中短,但可利用活体电穿孔法对很多皮肤疾病进行治疗。
肝 脏
由于肝脏的生理代谢十分旺盛,因此外源基因在肝脏中的表达时间往往很短暂,而且表达产物的水平也较低。为减少出血,可从小静脉注入，然后在肝脏上施加电场,能显著增强基因的表达。
睾 丸
相对于其他的转基因方法,活体电穿孔法可使外源基因在睾丸中产生大量和持久的表达。此外,很多研究人员希望利用活体电穿孔法将外源基因导入精子,
进而通过授精得到转基因动物。Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ]
用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手术法将动物人为造成隐睾,大部分体细胞和分化了的精母细胞减少,这样使外源基因导入精原细胞的几率增加。Ryoki
等[14 ]
将基因与病毒诱导的整合酶基因共转染,可在精原细胞中检测到外源基因的表达,且病毒诱导的双基因共转染较单基因整合效率更高。但目前用这种方法获得转基因动物还较难。
禽类输卵管
对禽类输卵管活体电穿孔的研究很少,但这一方法却有很广阔的发展前景。因为输卵管腺体细胞具有很强的分泌功能,可以将大量蛋白分泌到鸡蛋中。也可以利用此瞬时表达系统检测含卵清蛋白启动子的载体功能。Park
等用活体电穿孔法以荧光素基因导入鸡输卵管上皮,检测到荧光素活性约4500RLUPmg 组织[15 ] 。
眼睛、胚胎和禽类胚盘
这三种组织都是很脆弱的,如果实施基因枪法,会使靶组织因强烈的机械损伤而失去功能或直接导致发育停滞。Sakamoto
将血纤蛋白溶酶原激活因子基因导入眼睛中,有效抑制了眼睛在淤伤后血纤蛋白的反应。哺乳动物胚胎的电穿孔操作包括离体和子宫内操作。禽类胚胎基本是在蛋壳中进行电穿孔的,而且表达快速,Momose
等报道电穿孔施加后215
小时在鸡胚中就可以检测到外源基因的表达,这在使用病毒载体时也是不可能的。当电场被限定在一个很小的范围内时,基因可以定点表达,
这是活体电穿孔法的又一优点,Katahira 等[17 ] 证实可将外源基因导入鸡胚大脑、心脏和一些微小组织(如中胚层,间充质和体节)
中进行表达。
6、 活体电穿孔法进行基因治疗及外源基因表达的调控
6．1 活体电穿孔法在基因治疗方面的应用
原来在基因治疗中利用活体电穿孔法将抗体或化疗药物导入肿瘤中,促进抗体和化疗药物的运送来进行治疗,现在则以特异的外源基因替代了抗体的应用,简化操作步骤同时降低了费用。
首先,在皮肤瘤和脑瘤的治疗中,电穿孔法可有效地将药物基因导入治疗部位。电穿孔法导入人单核细胞趋化物蛋白基因到大鼠脑瘤后,该蛋白在肿瘤的局部表达,同时在基因导入的部位可观察到巨噬细胞和白细胞的聚集。
同时有科学家从另一角度研究电穿孔对治疗肿瘤方面的作用,利用高电场强度的陡脉冲促使肿瘤细胞发生不可逆性电击穿而最终死亡,这种方法很适于局部组织肿瘤的治疗。
此外,活体电穿孔法还可以参与癌症的治疗,通过活体电穿孔法将基因导入机体后,导入组织可成为分泌抗体等物质的临时分泌器官,以抵抗癌细胞的侵蚀或代偿由于癌细胞的侵蚀而造成的机体多种生理机能的丧失。
除了可以利用活体电穿孔法对肿瘤进行局部治疗外,还可以治疗机体的内分泌系统和免疫系统的疾病。可在机体局部以活体电穿孔法导入编码分泌型蛋白的基因,这种重组的治疗蛋白可以随着血液循环分布到全身各种组织和细胞进行治疗。如在活体电穿孔骨骼肌导入EPO
基因后,可通过红细胞比容值检测到EPO 基因表达产物的增加。Yasui
等在小鼠体内检测到活体电穿孔法导入的胃泌素基因的表达产物和人的单克隆抗体。
在不远的将来,研究人员可以选择机体的一种组织的某个位置作为活体电穿孔的靶位点,将治疗基因从该位点导入进而表达,因此又可以把这个特殊的组织当作机体的一个人造的内分泌或免疫组织,对病人进行相应的治疗。活体电穿孔法可对系统疾病产生作用并且安全有效。将不同类型的耐药基因同时导入造血细胞,以扩大耐药范围和进行体内选择是基因治疗的重要策略,这类载体基因片段大多较长,进行传统基因导入有一定的难度。有报道可以用活体电穿孔法将醛脱氢酶基因和多药耐药基因共转移并在PA317
细胞中获得高效表达,转导率达98 % ,测定药物蛋白表达较常规方法增高4 倍。此外电穿孔法有很高的经皮促渗作用,可进行很多经皮给药的治疗。
6．2 基因治疗中外源基因表达的调控
研究人员大都不希望导入的外源基因过度表达,尤其在基因治疗中,我们希望外源基因表达的诱导和抑制能够得到控制。目前这方面的研究主要包括两个方面:效应元件调节和生理活动调节。效应元件的作用,例如类固醇类激素诱导的效应元件中,在卵清蛋白启动子5′远端019kb
处有一个雌激素效应元件,将具有此元件的基因导入成年母鸡后,在其皮下注射糖皮质激素和雌激素,便可诱导外源基因的高效表达,表达量较未经激素诱导的对照组增加10
倍。
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