FISH 荧光原位杂交实验
实验概要
1. 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和实验技术
2. 掌握原位杂交技术的操作方法及荧光显微镜的使用方法
3. 了解其在生物学、医学领域的应用
实验原理
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代初期在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、杂交特性高、检测信号强和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素对探针进行标记，杂交之后用耦联荧光素的抗生物素的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是用荧光素直接标记探针。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能将信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
主要试剂
簇毛麦DNA探针
小麦基因组DNA
鲑鱼精DNA（Salmon sperm DNA, 10mg/ml）
去离子甲酰胺
20×SSC
50%硫酸葡聚糖
PI（碘化丙啶）溶液
FITC-conjugated avidin
BSA
无水乙醇
主要设备
恒温水浴锅
培养箱
染色缸
载玻片
荧光显微镜
盖玻片
封口膜
200mL移液器
20mL移液器
实验材料
簇毛麦－小麦易位系（6VS/6AL）中期染色体标本
实验步骤
1. 染色体制片：经-70°C冰冻后揭去盖玻片，在100%酒清中脱水过夜，气干。
2. 配杂交液：按每张18mm×18mm制片10μl体积配制杂交液，依次向1.5ml Ependorf管中加入：
| 药品 | 用量（6张制片） | 终浓度 |
| 鲑鱼精DNA（Salmon sperm DNA, 10mg/ml） | 18μl | 3μg/μl |
| 封阻DNA（小麦基因组DNA，1.2μg/μl） | 14μl | 0.3μg/μl |
| 在旋涡上混匀，抽干后（约30分钟）继续加入： | ||
| 簇毛麦DNA探针 | 12μl | 0.002μg |
| 去离子甲酰胺（Deonized Formamide） | 30μl | 50% |
| 20×SSC（3M NaCl, 0.3M醋酸钠） | 6μl | 2×SSC |
| 50%硫酸葡聚糖（dextran sulfate） | 12μl | 10% |
总体积 60μl
杂交液配好后在旋涡器上充分混匀。
3. 杂交液变性：杂交液用封口膜封上，在沸水浴中变性10分钟，立即置冰上，冰浴至少5分钟。
4. 染色体变性：制片在70%甲酰胺中（35ml甲酰胺，5ml 20×SSC，10ml ddH2O）78°C下处理1’10”，取出后立即在-20°C的70%、95%、100%乙醇中脱水各5分钟，气干。
5. 杂交：每张制片加10μl经变性处理的杂交液，盖上18mm×18mm盖片，放在保持湿润的保鲜盒中，置37°C杂交箱中杂交6小时以上（通常过夜）。
6. 洗脱：取出经过杂交的制片依次在2×SSC（室温，5分钟）、2×SSC（42°C，10分钟）、2×SSC（室温，5分钟）和1×PBS（室温，5分钟）溶液中洗脱未杂交的探针。
7. 配检测液及检测：
（1）使用前，按每张制片70μl配检测液，依次向1.5ml Ependorf管中加入：
药品 | 用量（6张制片） |
BSA（10mg/ml） | 180μl |
ddH2O | 186μl |
10×PBS | 42μl |
FITC-conjugated avidin (Enzo diagnostic, 500μg/ml) | 12μl |
总体积 420μl （2）混匀后，每张制片加70μl，盖20mm×20mm盖玻片，37°C，30min以上，保持黑暗。 （3）移去盖玻片，在黑暗下依次用1×PBS（室温，5分钟）、1×PBS（室温，5分钟）、1×PBS（室温，5分钟）冲洗，然后仍在黑暗下依次经过70%、95%、100%乙醇脱水各5min，气干。 （4）套染、封片：每张制片加12μl PI稀释液，盖上22mm×22mm盖片封片（保持黑暗）。
8. 观察和照相：先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。簇毛麦杂交信号呈黄绿色，小麦染色体被PI染成红色。照相记录实验结果。
注意事项
附1 FISH相关部分溶液的配制 1. 20×SSC：175.3g NaCl, 882.g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH至7.0） 2. 10X PBS:76g NaCl,18.8g Na2HPO4×7H20,4.1g NaH2PO4×H20,加水至1000mL（调pH 至7.0） 3. PI溶液配制：400μl Vectashield TM Mounting medium for fluorescence 10μl PI母液
附2 探针的生物素标记 探针的标记可采用随即引物扩增法、%E
