Pepfinder软件对单克隆抗体进行肽图分析（一）
1前言
在蛋白质药物产品的质控要求中，肽图分析是其中重要的一环。肽图分析包括对蛋白氨基酸序列进行确证及相关修饰的鉴定和定量。根据蛋白药物质谱分析特点和生物制药应用的特殊需求，Thermo Fisher与Amgen联合开发了PepFinderTM 软件。
PepFinder不仅具有最基本的肽段序列确证、覆盖率分析、修饰位点鉴定与定量、二硫键分析、图谱对比和肽段CID/HCD/ETD谱图解析等功能，还具有其独特功能，如未知修饰搜索功能和氨基酸突变搜索功能[1-5]。这两项功能可以帮助分析人员快速发现可能出现的序列突变，从而大大降低出现质量风险的几率。同时，PepFinder还有更多实用的功能设计，如内置CHO细胞系糖型、具有肽段鉴定可信度评价功能，还可根据碎裂方式和能量智能预测多肽的理论碎裂谱图，并用于与实验图谱直观对比，以辅助分析。这些功能不但减少工作强度，也降低了对分析员理解质谱数据深度的要求。对于氨基酸固定修饰设置，不同于其它类似软件（固定修饰只可精确至某一类氨基酸），在PepFinder中，可以精确到特定的某个氨基酸位点。 此功能对于蛋白药的某些特殊分析需求提供了极大的便利。
2 PepFinder功能介绍
2.1 PepFinder基本功能
图1显示了PepFinder搜库得到的序列覆盖度结果，图中不同颜色代表信号强度。从图中可以看出，单抗标准品的轻重链覆盖度均达到了100%；PepFinder还可对脱酰胺进行定量，这对于生物医药分析人员是非常有用的。图2显示了PepFinder生成的修饰情况总结；图3展示了一条包含脱酰胺修饰肽段SNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK的定性以及定量情况。
2.2 PepFinder2.0新增功能
在PepFinder软件的2.0版本中，加入了De Novo（从头测序，指对于没有蛋白序列的物种，根据质谱碎片信息利用生物信息学计算，对序列重新拼接和组装，以得到蛋白序列的技术）功能，可对所有肽段进行De Novo Sequencing（图4），或单独对某一张MS/MS谱图对应的肽段进行De Novo Sequencing（图5）。
在PepFinder2.0软件中，新增了 mgf格式文件输出功能，供MASCOT用户进行HCP分析；还新增了Pinpoint txt文件输出功能，供Pinpoint用户进行蛋白绝对定量；方便生物制药用户使用不同软件对数据进行深度分析，大大减少工作人员在数据处理上耗费的时间和精力。
从图3中可以看出，使用PepFinder软件可获得连续的肽段碎片离子，提高了鉴定结果的可靠性；分别对N416和N429两个可能发生脱酰胺修饰的位点进行定量，可以得到N416的脱酰胺比例为2.28%，N429的脱酰胺比例为2.90%。对于生物医药行业分析人员，脱酰胺修饰量的变化是药物稳定性测试的重要参数，PepFinder软件可提供精确到位点的脱酰胺定量信息，为分析人员提供有力参考。
3 PepFinder独有功能介绍
在PepFinder软件中，只要导入单克隆抗体的序列，即可自动计算出该抗体的重链末端K丢失后分子量、还原后（未还原）轻/重链分子量、无糖/脱糖重链分子量和各种常见糖型重链分子量等（图6）；目前，此功能为PepFinder软件独有，其他类似软件尚无此功能。
PepFinder软件还可对二级谱图进行预测，在类似软件中，PepFinder软件预测得到的二级谱图最接近真实碎裂的谱图（图7）。
图1 PepFinder序列覆盖度结果
图2 PepFinder生成的修饰情况总结
