细胞凋亡检测操作流程2——BrdU检测凋亡细胞DNA断裂片段
凋亡检测操作流程
二、 BrdU检测凋亡细胞DNA断裂片段
相关试剂及组分：
一步法: APO-DIRECT试剂盒（货号：556381）：
| PartA（4°C保存） | PartB（-20°C保存） |
| PI/RNase A Solution | FITC-dUTP |
| Reaction Buffer | TdT Enzyme |
| Rinsing Buffer | Negative Control Cells：已固定细胞 |
| Wash Buffer | Positive Control Cells：已固定细胞 |
二步法: APO-BRDU™试剂盒（货号：556405）：
| PartA（4°C保存） | PartB（-20°C保存） |
| FITC-Labeled Anti-BrdU mAb | Br-dUTP |
| PI/Rnase staining buffer | |
| Reaction Buffer | TdT Enzyme |
| Rinsing Buffer | Negative Control Cells：已固定细胞 |
| Wash Buffer | Positive Control Cells：已固定细胞 |
实验操作（适用于APO-DIRECT试剂盒）：
1. 细胞固定：、1) 用PBS洗细胞后，将细胞重悬于1%多聚甲醛的PBS溶液中，浓度为1-2x106/ml，冰浴30-60分钟。
2) 300xg离心5分钟，弃上清。
3) 用5ml PBS洗细胞两次，重悬于70%乙醇中，浓度为1-2x106/ml，冰浴30-60分钟。（70%乙醇细胞悬液在-20°C放置12-18小时后进行细胞凋亡检测，得到的效果最好。细胞可以在-20°C保存几个月。）
2. 配制染色液，现用现配。
| DNA标记液 | 1个测试 | 5个测试 | 10个测试 |
| Reaction Buffer | 10.00μl | 50.00μl | 100.00μl |
| TdT Enzyme | 0.75μl | 3.75μl | 7.50μl |
| FITC-dUTP | 8.00μl | 40.00μl | 80.00μl |
| 蒸馏水 | 32.2500μl | 161.25μl | 322.50μl |
| 总体积 | 51μl | 255μl | 510.00μl |
3. 细胞染色：
1) 取离心管和Falcon试管，按标本顺序编号。
2) 取1x106细胞悬液加入离心管中，300xg离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
质控细胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混匀后取1ml（细胞数约 1x10^6/ml）加入离心管中，300xg离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
3) 每管各加入1.0ml Wash Buffer，洗细胞两遍，弃上清。
4) 加入DNA标记液50μl重悬细胞。
5) 37°C温育60分钟（或者室温过夜），每15分钟摇匀一次。（非质控细胞37°C温育时间需根据不同 情况有所凋整。）
6) 每管加入1.0ml Rinse Buffer，300xg离心5分钟，弃上清。重复两遍，弃去上清。
7) 加入0.5ml PI/RNase A Solution，混匀。若细胞浓度低，可将用量调整到0.3ml。
8) 室温避光孵育30分钟。
9) 3小时内上流式细胞仪测定结果。
