免疫荧光实验方法-2
（二）固定和通透
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：
①防止细胞从玻片上脱落；
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；
③使标本易于保存。
标本的固定原则是：
①不能损伤细胞内的抗原；
②不能凝集蛋白质；
③应保持细胞和亚细胞结构；
④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。通常，细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂，如Triton
,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和
Leucoperm等。Triton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。Triton
X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（三）封闭
封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5,其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。
（四）抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
（五）封片及荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。
（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染。
