呼吸道合胞病毒感染对豚鼠咳嗽相关气道功能及...（二）
1材料与方法
1．1
主要实验仪器和试剂 胎牛血清及MEM、DMEM／F12培养基购自美国Gibco公司，辣椒素购自美国Sigma公司，VRl鼠抗单克隆抗体均购自英国Abcam公司。HRP标记免疫组化二抗购自美国Invitrogen公司。单腔非限制型小动物体描仪购自美国Buxco公司，Leica DM4000智能型生物显微镜购自德国Leica公司。
1．2细胞培养和RSV的培养、收获及定量 人喉癌上皮细胞株(Hep一2)和RSV病毒株均来源于美国ATCC，Hep一2细胞是对RSV敏感的细胞，用于病毒株的传代培养。当Hep一2细胞在培养瓶中长至70％～80％融合后，取病毒悬液接种于细胞上，每15分钟摇动1次，吸附2 h后倒出病毒液，加入2％胎牛血清的培养基，于第2～3天开始出现细胞病变，待病变达50％～60％时收获病毒，将细胞反复冻融2～3次后lO000 r／min，4℃，离心20 min，去除细胞碎片，收集上清分装后液氮中冻存。空斑技术测定病毒感染滴度，以空斑形成单位(pfu)来表示病毒感染滴度。
1．3动物分组、饲养、病毒接种和哮喘模型制作 雄性纯白SPF级豚鼠来自广东省实验动物中心，体质量250～300 g。随机分成5组，即正常对照组和4个病毒感染组。病毒感染组按病毒感染后天数又分为感染后6、12、28和42 d四个组。每组10只。SPF级环境下饲养，感染组动物单独饲养，在适应新的环境1周左右后开始接种病毒。病毒滴鼻：乙醚麻醉后，两侧鼻孔分别滴入75“l的事先扩增冻存好的病毒液，病毒滴度为3．72×105 pfu。哮喘模型制作：腹腔内注射含5％鸡卵自蛋白和10 g／L氢氧化铝混合液1 m1致敏，15 d后予卵白蛋白吸人诱发哮喘发作。
1．4豚鼠CRS的测定通过辣椒素咳嗽激发试验判断气道的CRS。其原理是通过雾化吸入特异性的刺激物，激活气道感觉神经末梢的咳嗽感受器，诱发咳嗽的产生，以激发物的浓度和咳嗽程度判断CRS。辣椒素是红辣椒的刺激成分提取物，因为其安全、剂量依赖性和可重复性好，所以很适合用作CRS的评价。用单腔非限制型小动物体描仪测定豚鼠的CRS，各组动物分别在预定时间进行辣椒素咳嗽激发试验，判断CRS的指标主要是咳嗽总次数(CCnt)，方法参照Lewis等口1的研究所描述的。辣椒素激发溶液浓度为50弘mol／L，总量为1 ml，观测记录10 min(含雾化时间)内的CCnt。
1．5
豚鼠气道高反应性(AHR)的测定 CRS测定后12 h，用Buxco无创肺功能仪检测豚鼠的增强呼气间歇(enhanced pause，Penh)。测定100弘l倍增浓度的乙酰甲胆碱(MeCh)雾化激发后Penh的变化，激发浓度由低到高，依次为100、200、400、800、1 600 mg／L，记录各浓度级MeCh激发下的Penh平均值。将每个MeCh激发浓度下的Penh值转换为与生理盐水激发时Penh值的百分比，以Penh％表示，作为AHR的评价指标。
1．6
Real—time PCR方法检测肺组织VRl的mRNA相对表达 Primer5．o设计的RSV引物序
列如下：VRl正义引物：5’一TCAAAGACCC—GGAAACAGGG一3’，反义引物：5’一CTCTACCA—GGAGGGTCACCA一3’，产物224 bp；GAPDH(内参照)正义引物：57一TGGTGCCAAAAGGGTCA一3’，反义引物：5’一CCTCCACAATGCCGAAGT一3’，产
物176 bp。提取组织总RNA。采用2一心、相对定量法来计算VRl mRNA的表达水平。
1．7免疫组织化学方法检测豚鼠肺组织VRl和PGP．9．5蛋白的表达及免疫组化结果图象分析(半定量方法)
DAB染色免疫组化图片用Leica显微镜观察、拍照，进行蛋白表达强度(灰度)的比较。根据以下染色深浅行半定量分析：0=无染色；1一轻度着色；2一中度着色；3一强着色；4一很强着色(几乎呈黑色)。每张片子至少随机分析5个高倍视野。所有片子均由2个不知情的人分析。
1．8统计学处理 采用SPSS 16．o统计软件进行分析，数据以z±s表示。因样本数不多，标准差偏大，各组间总体检验采用非参数经验Kruskal—Wallis法，组间比较采用Bonferroni的组问比较检验法。P<o．05为差异有统计学意义。
2
结果
2．1
豚鼠CRS测定结果感染后6、12、28和42 d组豚鼠CRS分别为：(8．oo±3．86)、(8．70±6．20)、(7．60±4．40)和(6．70土3．71)CCnt，均较正常对照组[(2．50±1．43)CCnt]升高(P<o．05)，以感染后12 d组升高最为明显(P<0．01)；而哮喘组CRS为(3．90土1．60)CCnt，与正常对照组比较差异无统计学意义。
2．2豚鼠AR的改变
图1结果显示，急性感染后12 d组豚鼠AR对2个高浓度MeCh刺激结果是(1 069土156)％和(1 846±285)％，均高于正常对照组(P值分别<0．05和o．01)。虽然其他感染组部分豚鼠AR也有一些不同程度的增高，尤其是第28天组，但由于个体差异大，整体与正常对照组相比差异无统计学意义。而哮喘组豚鼠与正常对照组相比均有明显AHR。
注：哮喘组与正常对照组比较。aP<0．05，6P<0．01；感染后12 d组与正常对照组比较，cP<0．05。6P<0．01
图l
呼吸道合胞病毒实验豚鼠气道高反应性的改变(H一8)
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项目成果
