转录因子Sp9参与神经纹状体苍白球发育过程
研究人员发现锌指转录因子——Sp9，在LGE祖细胞中广泛表达，对维持有丝分裂期后的纹状体苍白球MSNs至关重要，为我们理解神经元发育过程提供了新的证据。
研究背景
纹状体是基地神经节的重要组成部分，是一类中型多棘神经元（MSNs）。MSNs的两个重要的基地神经节亚型分别是纹状体黑质（直接通路）和纹状体苍白球（间接通路）。纹状体中5%-10%的神经细胞为多棘内在神经元。已有研究发现一些转录因子（TFs）参与纹状体黑质MSNs的形成，但是TFs在纹状体苍白球MSNs形成过程中的作用还不清晰。本研究通过对一个锌指蛋白转录因子Sp9的深入研究，阐述了该转录因子在纹状体苍白球发育过程中的重要作用
研究思路
研究结果
1. Sp9表达模式分析表明其在神经纹状体苍白球中特异表达
为了系统性了解的转录因子Sp9在大脑中表达和功能，研究人员构建了Sp9多克隆抗体和突变体alleles，Sp9-LacZ null allele(Sp9LacZ/+)和Sp9 floxed allele(Sp9Flox/+)。
检测显示，Sp9-LacZ在E10.5期的神经节（GEs）中广泛表达。免疫细胞化学实验和RNA杂交实验表明Sp9 RNA和蛋白在E13.5期的室下区域（SVE）和地幔区域的LGE，MGE和CGE区域广泛表达。同时，在SVE的Sp9+细胞中，神经前体蛋白Ascl1和细胞增殖marker Ki67也有明显表达。在胚胎发育阶段，Sp9在大部分的迁移皮质神经节中表达。
通过构建Sp9-Cre knockin小鼠，研究人员发现Sp9+祖细胞产生了96%以上的皮层中间神经元和VIP（肠血管活性肽）+亚型和几乎所有的纹状体中间神经元。Foxp1是特异性的在有时分裂后期的MSNs细胞中表达，结果显示所有Foxp1+细胞中都有Sp9-Cre表达，表明Sp9-Cre在纹状体黑质和纹状体苍白球MSNs中被激活。此外，研究人员也发现Sp9-Cre在嗅球细胞（OB）中间神经元中表达。
通过Drd2-EGFP转基因小鼠，研究人员构建了Sp9纹状体表达模型小鼠。结果显示，Sp9在胎儿纹状体中强烈表达，一直持续到婴儿时期。在E16.5，P0, P5,P17和P35期的纹状体苍白球中都表达Sp9。该结果表明，在MSNs有丝分裂期后，Sp9特异性地在纹状体苍白球MSNs中特异表达。
2. Sp9突变小鼠中纹状体苍白球MSNs的生成和凋亡受影响
为探究Sp9的生物学功能，研究人员对Sp9 Laz/Laz突变小鼠进行了分析。结果显示，突变体小鼠发育较弱，持续到P7还是发育无力，在P14开始死亡，在P22期已没有存活的小鼠。同时，Sp9突变体小鼠的大脑大小和重量也都比正常的小。
表型分析显示，Sp9突变体小鼠大脑纹状体严重萎缩，在P9期体积是对照的54%。同时，相对于Sp9LacZ/+小鼠，Drd2-EGFP 小鼠中Foxp1+细胞减少57%，Sp9LacZ/LacZ小鼠中，Foxp1+/Drd2-GFP+细胞减少了97%，且在纹状体中非均匀分布。在背内侧纹状体中，Foxp1+/Drd2-GFP+细胞也很难检测到，但出现在了侧纹状体中。对Drd2的原位杂交实验也确认了该类细胞的缺失。此外，突变体小鼠的Enk+细胞严重减少，进一步表明纹状体苍白球MSNs的缺失。只有很少的Drd2-GFP+细胞出现在背侧纹状体中，属于中间神经元亚型。另外，Drd1-GFP在纹状体特异性的在黑质细胞中表达，Sp9LacZ/LacZ突变体中纹状体黑质MSNs的GFP表达并没有明显变化。该结果表明，Sp9突变只影响了纹状体苍白球的发育。
研究人员对E13.5和E15.5小鼠LGE进行30-min BrdU 脉冲标记。结果显示，E13.5期突变体BrdU+细胞在SVZ中减少。E15.5期突变体中BrdU+细胞在SVZ祖细胞和SVZ Foxp1+有丝分裂期后MSNs中都减少。
研究人员接下来进行了BrdU birth-dating分析。在E12.5期注射BrdU，在突变体和对照P0期统计BrdU+和BrdU+/Foxp1+细胞，发现两者都明显减少。因此，缺失了Sp9影响了LGE SVZ的循环祖细胞的缺失。
对Sp9LacZ突变体中β-gal+和β-gal+/Foxp1+细胞数目统计，发现数量显著减少。由于Sp9主要在纹状体苍白球细胞中表达。所以，Sp9的缺失影响了纹状体苍白球MSNs的产生。
对E16.5期的纹状体MSNs中10个纹状体MSN markers进行原位RNA杂交检测，发现5个纹状体黑质marker(Drd1,Tac1,Ebf1,Pdyn,Chrm4)和5个纹状体苍白球marker(Drd2, Penk, Gpr6, Adora2a, Ptprm)在Sp9LacZ/+controls中都表达。在Sp9 LacZ/LacZ突变体SVZ和纹状体中，纹状体苍白球MSN markers显著下调，qRT-PCR结果也验证了该结果。但是，纹状体黑质markers表达没有显著影响。
对E16.5和P0期纹状体Drd2-EGFP检测，发现在突变体的SVE和纹状体中，Foxp1+/Drd2-GFP+ MSD细胞更少。因此，这些结果都显示，Sp9特异性地促进纹状体苍白球MSNs的生成。
研究人员接下来分析了Caspase-3表达，以检测出生后Sp9LacZ/LacZ突变鼠纹状体的细胞死亡。结果显示，突变体在出生后不同时间Caspase-3+细胞增加显著大于对照。由于在Caspase-3+细胞中并没有检测到Drd2-GFP的表达和纹状体黑质MSNs的减少，所有在Sp9突变体纹状体中，死亡的细胞为未成熟的纹状体苍白球MSNs。
为探究突变体纹状体苍白球 MSNs凋亡是否为Bcl-2-associated X 蛋白（Bax）-依赖，研究人员构建了Sp9LacZ/LacZ； Bax-/-双突变体。结果显示，双突变体在P3期纹状体细胞死亡几乎消失，Foxp1+细胞数量明显高于单突。值得注意的是，这种增加的Foxp1+细胞并不能转化成成熟的纹状体苍白球MSNs。因此，除了促进LGE增殖和生成，Sp9还影响了纹状体苍白球神经元的分化和成熟过程。
为进一步分析Sp9对纹状体苍白球MSNs有丝分裂期后的作用，研究人员构建了条件性敲除突变系Drd2-Cre；Sp9Flox/Flox；Rosa-YFP+小鼠。突变体中的Foxp1+和Foxp1+/GFP+细胞明显减少。在P0，P3和P5期条件性突变体Caspase-3+细胞数量也明显上升。因此，Sp9条件性缺失突变体的Drd2+纹状体苍白球MSNs的缺失与细胞程序性死亡相关，说明Sp9对于纹状体苍白球MSNs有丝分裂期后的生存相关。
那么，这种纹状体苍白球MSNs的缺失会造成什么样的生理问题呢？结果显示，条件性突变小鼠的移动能力受到了影响，表现出更强的移动能力。但是在旋转测试能力中并没有显著差异。因此，Drd2-Cre；Sp9Flox/Flox小鼠的快速移动能力增强，但不影响焦虑和运动协调能力。
3. Sp9作用分子机制探究
已有报道显示Ascl1与小鼠Dre2+MSNs的生成有关。研究人员用原位RNA杂交进行了确认。与对照相比，Ascl1GFP/GFP突变小鼠中在P0期Drd2表达显著下降。在E14.5和E16.5期，Ascl1GFP/GFP突变小鼠背侧LGE SVE中的SP9蛋白与RNA表达都减少，暗示着Ascl1可以正向调控了Sp9的表达。
为进一步验证其调控关系，研究人员分析了Sp9的启动子区域，发现有Ascl1的保守结合位点（E-box sites, CAGCTG or CACCTG）。ChIP qPCR实验表明两者确实能够结合。
对P19期胎瘤细胞进行双荧光转录活性实验也验证了Ascl1可以通过（CAGCTG）结合Sp9 E245激活Sp9的转录。因此，这些结果表明Ascl1通过直接结合到Sp9的启动子区促进LGE SVE中Sp9的表达。
找到了上游调控因子，Sp9在下游又是影响了那些基因的表达呢？通过对Drd2-Cre；Sp9Flox/Flox条件敲除小鼠进行RNA-seq(由上海伯豪提供)，发现有90个基因发生显著变化。其中，GPCRs(Adora2a, Gpr6, P2ry1)在Sp9条件突变体纹状体中显著下调。为确认RNA-seq结果，研究人员对E16，E18，P4期小鼠进行原位RNA杂交。结果显示，他们确实都显著下调了，其中Adora2a几乎检测不到。因此，Sp9可能是影响了纹状体苍白球MSNs中Adora2a的表达。
研究结论
该研究通过表达模式分析发现了转录因子Sp9在LEG祖细胞中的广泛表达。运用Sp9-null突变小鼠，发现Sp9对于纹状体苍白球MSNs的增殖，凋亡密切相关。进一步的ChIP qPCR实验验证了Sp9受到上游Ascl1的调控。RNA-seq实验表明Sp9促进了下游GPCRsa家族蛋白的表达实现生物学功能。该研究深入理解神经节发育过程中纹状体苍白球MSNs的产生，分化和生存过程提供了新的证据。
原文出处: Zhang Q, Zhang Y, Wang C, et al. The Zinc Finger Transcription Factor Sp9 Is Required for the Development of Striatopallidal Projection Neurons. Cell Rep. 2016 ,16(5):1431-44.
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