RNA逆转录(RT)过程
一，准备工作
1， 实验器具与材料: (1)移液枪:200ul、10ul (2)吸头:200ul、20ul (3)EP 管 1.5ml、100ul (4)水浴箱 2，实验器具的处理与准备
逆转录(RT)
塑料制品:(包括吸头、EP 管等)
将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC 水中(必要时小枪头需要用吸管打
入 DEPC 水)37°C过夜，然后送至高压 3 次，后在 80°C烘烤箱中烘干(或置于
37°C中 8 小时左右烘干)，试验前将枪头放入吸头台。 3，试剂配制和准备:
(1)DEPC 水:泡实验器具的 DEPC 水的配制:1000ml 双蒸水中加 1mlDEPC，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。逆转录中所用的 DEPC 水的配 制:100ml 盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加 40ulDEPC，37°C过夜，送至 高压，后分装到几个 1.5mlEP 管中，-20°C中保存备用。
(2)RT 中所需要的各种试剂 (3)引物浓度计算方法: (新合成的引物的稀释)
假如终浓度为X uM(pmol/ul)
加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X) 二，RT 时注意事项:
为避免 RNA 酶污染，在 RT 中仍要佩戴一次性手套和口罩。 三，RT 步骤
用 SSIII逆转录酶进行 RT(20ul 体积)
1， 准备0.65ml的EP管
2， 冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短 暂离心。
3， 65°C水浴5分钟后，立刻0°C冰水浴至少1分钟。
4， 短暂离心后，冰上操作:加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAse Inhibitor，1ul SSIII逆转录酶。
5， 短暂离心
6， 50°C水浴60分钟进行逆转录。
7， 70°C水浴15分钟灭活逆转录酶
8， -20°C保存，或立即进行PCR。
用 AMV 逆转录酶进行 RT(10ul 体积)
1， 准备 0.65mlEP 管
2， 加入 4.5ul DEPC 水，1ul 引物，1ul 模板 RNA
3， 稍离心，100°C沸水裕 1min
4， 加入 0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV 逆转录酶 5， 稍离心，封口膜封口，42°C水浴 90°C作 RT
6， 100°C沸水裕 3min 灭活 AMV
7， 立即 PCR 或-20°C保存。
