细胞化学技术-4
6、基本实验过程
用于大分子合成过程研究的放射自显影技术：
同位素标记示踪化合物→注入动物体内→ 取下器官或组织→切片→
涂乳胶膜→自显影→显影和定影→染色→观察
用于大分子定位研究的放射自显影技术：
组织固定包埋→切片
↓
细胞化学反应→涂乳胶膜→自显影→显影和定影→染色→观察
↑
同位素标记示踪化合物
四、原位杂交技术
原位杂交技术（in situ
hybridization）是以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。
（一）原位杂交技术的原理
原位杂交技术的原理是：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
1、核酸分子杂交
DNA双链分子在一定条件下可以发生变性和复性的过程。分子杂交技术利用的就是两条互补的DNA单链能够复性的性质。分子杂交是碱基互补的两条异质核酸单链在一定条件下缔合形成双链分子的过程。这一过程相当于DNA的复性，只是核酸单链的来源不同。
原位杂交技术中，以经过标记的已知核酸分子为探针，以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子，造成一定条件使探针与靶核酸分子在原位发生杂交，然后再对其探测。
2、探针标记
探针是经过标记的核酸分子，与待测DNA或RNA序列互补。探针主要有cDNA、RNA和寡核苷酸。
探针标记物有放射性的和非放射性的两类。常用的放射性标记物主要有35S、32P、33P和3H。非放射性标记物主要有荧光素、生物素、地高辛和溴脱氧尿嘧啶等。通常标记物被导入某个单核苷酸而形成标记分子，如四甲基罗达明-UTP、生物素-UTP、地高辛-dUTP等。然后通过各种酶促反应，如随机引物法或PCR法，使标记分子参入探针。
3、杂交
不同来源的序列互补的单链核酸分子在一定条件下借氢键相连而形成双链杂交分子的过程为杂交。杂交可发生于RNA与DNA、DNA与DNA、RNA与RNA之间。形成的双链杂交分子为杂交体（hybrids）。
4、杂交体的探测
对杂交体的探测根据探针标记物的不同而采用各种方法，目的是使标记的杂交体在光镜或电镜下可见。
⑴ 放射自显影 如果探针是同位素标记的，显示杂交反应的方法就是光镜或电镜水平的放射自显影技术。方法是在切片上涂覆核子乳胶膜后置于暗盒中于4℃自显影一段时间，然后经显影和定影后观察银离子在细胞和细胞器分布情况。
⑵ 免疫细胞化学
对于非同位素标记的探针，可根据免疫细胞化学原理用直接法或间接法将探针标记物显示出来。也就是采用那些在光镜或电镜下具有可见性的免疫细胞化学标记物来直接或间接地显示杂交探针标记物。如用地高辛标记探针杂交后，需加入碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体，再加入酶的底物来显示杂交体。
（二）实验方法
原位杂交技术的实验方法主要包括：标记探针的准备，组织样品制备，杂交和杂交体探测。
1.标记探针的准备 对cDNA、RNA和寡核苷酸三种探针的选择，要考虑
所要检测的靶核酸分子的性质，如cDNA 和RNA 适宜于检测mRNA分子，寡核苷酸对mRNA的杂交效率和特异性都不如RNA探针。
2.组织样品制备
光镜原位杂交标本的固定多使用4%多聚甲醛，常规石蜡包埋和切片，但在操作过程中应提防RNA酶污染。电镜原位杂交标本的固定也采用4%多聚甲醛。与免疫细胞化学技术一样，电镜水平的原位杂交可以在未经包埋的组织切片上进行，称包埋前技术；也可以在超薄切片上进行，称包埋后技术。冷冻切片能较好的保存靶核酸因而较易获得杂交信号，但对细胞结构的保存较差。
3.杂交 杂交是在一定温度和离子强度条件下让标记探针与组织中靶分子结
合的过程。杂交的效率和特异性是优化杂交条件的出发点，也是需要兼顾的两个方面。影响因素主要是探针的结构、杂交温度、杂交液中的甲酰胺浓度和离子强度、杂交后漂洗等。要通过实验对条件进行优化。
4.杂交体探测 根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免疫细胞化学
方法显示杂交结果。
5.基本实验过程
探针标记→纯化→(变性)
↓→涂覆乳胶→放射自显影
原位杂交→杂交体探测：→加酶联抗体→加酶底物显色
↑→金银染色
样品制备→切片→通透处理
