细胞化学技术-2
二、 免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗原抗体特异结合的特性定位组织和细胞中特异大分子的一类技术。它包括光镜水平（简称免疫组化）和电镜水平(简称免疫电镜)的免疫细胞化学技术。应用免疫细胞化学技术可在原位检测细胞的各种大分子，如蛋白质、多肽、核酸、多糖和磷脂等。
（一）免疫细胞化学技术的原理
免疫细胞化学技术的原理是：把组织中的特异分子作为抗原，用各种在显微镜下
可见的标记物标记特异抗体或标记抗原抗体复合物，使特异的免疫化学反应具有可见性，从而间接地显示抗原，达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。
1． 抗原
用免疫细胞化学技术检测的分子可以是各种大分子，它们在这一技术中扮演抗原的角色。所以，细胞中的任何分子，只要其结构复杂到一定程度，具有免疫原性，能作为抗原或半抗原，从而能导致针对它的抗体产生，都能作为靶分子，用该技术得到检测。它们可以是蛋白质、多肽、核酸、多糖和磷脂等，最常见的待检分子是蛋白质、多肽。除了检测组织和细胞中天然存在的蛋白质、多肽，该技术还能检测在培养细胞中人为表达的重组蛋白质分子。方法是利用分子生物学技术制备重组DNA时导入一段序列，该序列编码一个多肽与重组蛋白质连接在一起，该多肽作为抗原或半抗原能导致针对它的抗体产生。当这一重组DNA在培养细胞中表达时，可以因为含有特异抗原或半抗原多肽，而能用免疫细胞化学技术检测到，因而重组蛋白质也就能在同处被检测到。免疫细胞化学技术的这种巧妙应用，近来在研究新克隆得到的蛋白质分子的定位中发挥很大作用，也为该技术开拓了更广阔的应用空间。
2． 抗体
单克隆和多克隆抗体，可从市售获得或自行制备。在免疫细胞化学技术中可以有
两个层次的抗体。针对抗原的抗体称为第一抗体，针对第一抗体的抗体称为第二抗体。
3．免疫细胞化学中的标记物
免疫细胞化学技术是用已知的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法，但抗原抗体相结合的复合物在显微镜下是看不见的，必须用特殊的标记物对抗体或抗原抗体复合物进行标记，才能使抗原抗体复合物在显微镜下具有可见性。常用的标记物有以下几种：
⑴荧光素用荧光素标记已知抗体，再与组织或细胞中的相应抗原结合，
在荧光显微镜下检测荧光素所发荧光，便可知抗原的分布部位，常用的荧光素有绿色荧光的异硫氰酸荧光素和红色荧光的罗达明B200等。
⑵酶用酶标记已知抗体，再与组织或细胞中的相应抗原结合，利用酶细胞
化学方法显示该标记酶以达到显示抗原的目的。常用的标记酶如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）与其底物H2O2和氨基联苯胺相遇时，形成的棕色沉淀可在光镜下观察到，遇锇酸反应后形成锇黑电镜下呈高电子密度。
⑶胶体金将胶体金与抗体结合形成金标记抗体，再与相应的抗原结合，形
成显微镜下可见的电子致密的金颗粒。常用的胶体金颗粒直径为5～60nm。
⑷亲和物质亲和物质是一种有多价能力的物质，不仅与另一种亲和物质有
高度的亲和力，而且可与抗体蛋白及各种标记物如荧光素、酶、胶体金等结合，因而可以通过荧光显微镜、酶加底物显色反应等定位某种特异分子。常用的亲和物质系统有生物素－亲和素系统、葡萄球菌A蛋白－免疫球蛋白系统。
⑸铁蛋白将铁蛋白通过一种低分子的双功能试剂与抗体相结合，它既保
留了抗体的免疫活性又具有显微镜下可见的高电子密度核心。
2、免疫细胞化学中的直接法和间接法
直接法：用标记的特异抗体直接检测相应抗原的方法称为直接法。
间接法：用未标记的特异抗体（第一抗体）与组织中的抗原结合，再用标记的第二抗体与第一抗体结合，间接检测组织中的抗原。这种方法因为在第一抗体上可以结合多个标记的第二抗体，所以其灵敏度比直接法更高
（二）实验方法
免疫细胞化学技术的实验方法包括标记抗体的准备、组织样品的制备及免疫细胞化学反应。
1、标记抗体准备 抗体标记的基本方法是利用分子间电荷等作用力或使用交联剂，将抗体与标记物连接在一起。但在绝大多数情况下，标记抗体从市场购得。
2、样品制备 样品固定时既要保存好组织细胞结构和抗原位置又要保存好抗原
性。常用的光镜固定剂为多聚甲醛，冷冻切片或常规石蜡包埋、切片；电镜样品多选用多聚甲醛与低浓度戊二醛（0.05～0.5%）混合液，锇酸损伤抗原性，不能在细胞化学反应前使用。电镜免疫细胞化学反应可在未经包埋的组织片上进行，称包埋前技术；也可在超薄切片上进行，称包埋后技术。此外，冷冻超薄切片可直接用于电镜免疫细胞化学反应。
3、基本实验过程
光镜样品
固定（抗原固定＋结构固定）→ 冷冻切片或石蜡包埋切片→
免疫细胞化学反应→ 光镜观察
电镜样品（包埋前技术）
固定（抗原固定＋结构固定）→切组织片→免疫细胞化学反应→脱水包埋
→超薄切片→电镜观察
电镜样品（包埋后技术）
固定（抗原固定＋结构固定）→脱水包埋→超薄切片
→免疫细胞化学反应→电镜观察
