细胞化学技术-1
细胞化学技术（cytochemistry）是在保持细胞结构完整的条件下，通过细胞化学反应研究细胞内各种成分(主要是生物大分子)的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化的技术，可以通俗地说，这类技术让人们在显微镜下看到细胞内大分子的位置。这类技术包括光镜和电镜水平的酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术和原位杂交技术等。
一、 酶细胞化学技术
酶细胞化学技术（enzyme
cytochemistry）是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。早期的酶细胞化学工作是在光学显微镜下进行的，称为组织化学（histochemistry），随着电镜技术的发展开始用电镜观察酶的分布，称为电镜酶细胞化学技术（electron
microscopic enzyme
cytochemistry）。酶细胞化学技术对研究细胞器的结构与功能、细胞的生理与病理过程以及细胞器的相互关系曾发挥重要作用。近来酶细胞化学技术的单独运用大为减少，但是这一技术的原理导致免疫组织化学或细胞化学技术的诞生和不断更新，而后者则是研究细胞中大分子定性和定位最简便有效的手段，正得到极为广泛的应用。因此有必要了解酶细胞化学技术。
（一）酶细胞化学技术的原理
显微镜下无法直接观察到细胞内的酶，通过酶细胞化学反应才能间接地反应酶的存在位置。酶细胞化学的原理是：在一定条件下，使组织细胞内的酶与其底物相互作用，形成初级反应产物，再用捕捉剂在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下可见。这一反应过程所示如下：
┌──── 酶细胞化学反应 ──────┐
初级捕捉剂最终
酶＋底物────> 反应产物 ─────> 反应产物
└─ 酶反应 ─┘└── 捕捉反应 ───┘
从上式可见，酶细胞化学反应实际上由两项反应组成。前面的酶反应相当于细胞内自然条件下发生的酶促反应，后面的捕捉反应则是为了使酶反应可见而人为造成的。
捕捉反应的目的是使酶反应产物形成在显微镜下可见的最终反应产物，即最终反应产物在光镜下具有鲜明颜色，在电镜下具有高电子密度。捕捉反应主要有金属盐沉淀法、色素形成和嗜锇物质生成法。如：金属盐沉淀法将重金属作为捕捉剂，使酶反应产物直接或间接与之结合生成金属盐沉淀。在色素形成和嗜锇物质生成法中，捕捉底物在酶作用下转化成色素沉淀于酶作用部位，在光镜下可见；或者捕捉底物转化成嗜锇物质，经锇酸作用后形成高电子密度的锇黑，在电镜下可见。
在生物化学中，酶被分成水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂合酶、合成酶和异构酶六大类。现以水解酶为例介绍如下：
初级反应： 底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸
最终反应： 磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物磷酸铅（黑色、高电子密度）
（二）实验方法
1、样品制备
酶细胞化学的一个重要问题是既要保存好细胞内酶的活性，又要保存好细胞的结构，因此选择适当的固定剂种类、浓度、固定的方式和时间是细胞化学技术的一个关键问题。光镜样品固定多选用中性福尔马林或多聚甲醛,4℃、24小时，常规的石蜡包埋切片可以满足相当一部分酶的细胞化学要求；电镜样品固定通常用0.5～2％戊二醛或4％多聚甲醛,4℃、2小时，再切成5～100μm的厚片用于细胞化学反应，反应后经常规的锇酸后固定，脱水、包埋、超薄切片、至电镜下观察。冷冻切片能较大限度地保存酶的活性，因此是光、电镜酶细胞化学技术中常用的方法。
2、酶细胞化学反应
酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程，孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉剂，保证孵育液pH
的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织通过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋和超薄切片，至电镜下观察。
3、基本实验过程
光镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→ 冷冻切片 → 细胞化学反应
（酶反应＋捕捉反应）→ 光镜观察
电镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→切组织片→细胞化学反应
（酶反应＋捕捉反应）→脱水包埋→ 超薄切片→电镜观察
