如何利用LAMP引物设计平台设计IMSA引物？-3
（3）找到该文档，邮件选择打开方式为记事本，可得引物信息。再次点击文档，另存为Up-LF或Down-LB.txt文件。这里的第16套引物，我们需要它的下游环引物即LB，故名为Down-LB。这样命名的目的是为了防止混淆；
（4）同样打开LAMP引物设计平台（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）并上传导入Down-LB.txt文件；
（5）依次点击Generate和Display，即可得相应环引物。
显然，有我们要选的LB。从高到低，依次为系统默认引物性能从强到弱的环引物。
Tip 3：如果某套引物无法自动设计出对应的环引物时，有三种策略：
一是点击DetailSettings，调整引物长度至15-28试试，不要轻易动Tm和GCrate两项设置；
二是可直接选取F1c和F2之间的序列作为上游环引物，或B1c和B2之间的序列作为下游环引物，但不得有很强的自身引物二聚体结构，且Tm值需在60-66之间。这只是无奈之举；
三是重复步骤8，重新挑选引物组合，使平台能自动设计出环引物为最佳。
11. 至此，以选择第16和39套引物组合为例，我们获得了IMSA引物设计所需的七个位点，从上游至下游依次为F3、F2、LF、F1c/B1c、B2、LB、B3，其中F1c和B1c完全互补，算作同一个位点。按着IMSA引物位点组合，可得：
IMSA外引物DsF=LF+F3
IMSA外引物DsR=LB+B3
IMSA内引物FIT=F1c+F2
IMSA内引物RIT=B1c+B2
IMSA茎引物SteF=LB
IMSA茎引物SteR=LF
12. 合成所设计的IMSA引物，并通过实际实验，从特异性、灵敏度和反应时间等方面来验证该引物是否合适。经济条件允许的话，可同时合成三套或三套以上，以缩短验证周期。
