1. 单个大肠杆菌克隆接种到 2 ml 含适当抗生素的 LB 中。37℃ 剧烈振荡孵育 5~8 小时。或者可以培养过夜使饱和。
2. 倒 1.5 ml 培养液到已作标记的微量离心管中。把剩下的培养液存放在 4℃。
3. 在微量离心机上离心 2 分钟以沉淀大肠杆菌。吸掉培养液。
4. 用 100 ul 葡萄糖缓冲液重悬沉淀物。在室温孵育 5 分钟。在这时候充分悬浮大肠杆菌对于获得尽可能大的产量是很重要的。
葡萄糖缓冲液（配 500 ml）
50 mmol/L 葡萄糖 4.5 g 葡萄糖
10 mmol/L EDTA，pH 8.0 10 ml 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0
25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 12.5 ml 1.0 mol/L Tris-HCl，pH 8.0
过滤除菌，贮存在 4℃。
5. 在管中加 200 ul NaOH-SDS 溶液，轻轻地颠倒混合。冰浴 5 分钟。溶液应该明显变清了，但仍然非常黏。
NaOH-SDS 溶液（配 50 ml）
0.2 mol/L NaOH 0.4 g NaOH
1% SDS 2.5 ml 20% (w/v) SDS
可在室温存放 2~3 周。
6. 每个管中加 150 ul 冷的 3 mol/L 乙酸钾，pH 5.2，颠倒混合；冰浴 5 分钟，会形成白色絮状沉淀。
3 mol/L 乙酸钾：
5 moI/L 乙酸钾 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
加水到 100 ml。贮存在 4℃。
7. 在小离心机上离心 5 分钟，然后转移 400 ul 上清到一个已作标记的管中。
8. 管中加 0.5 ml 酸/氯仿/异戊醇（50:49:1) 溶液，振摇，在离心机上离心 5 分钟。
酚/氯仿/异戊醇（50:49:1)
50% TE 饱和酚
49% 氯仿
1% 异戊醇
避光贮存于 4℃。
9. 小心地把水相（上层）转移到已作标记的管中。
10. 加 1.0 ml 100% 乙醇，混合，然后离心 5 分钟沉淀 DNA。
11. 去掉上清。应该能看到一个小的白色沉淀物。加 1.0 mI 70% 乙醇洗涤沉淀物，并离心 5 分钟。
12. 去掉上清。管子离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体，让乙醇挥发 5~10 分钟。（或者可以真空干燥管子。）
13. 用 25~50 ul 的 TE（pH 8.0）重悬沉淀物。质粒 DNA 应该很容易溶解。不易溶解的物质很可能不是 DNA。
14. 在这 32 uI DNA 溶液中加 8.0 ul 4 mol/L NaCl 和 40 ul 113% (w/v) PEG8000。混合均匀并冰浴 1 小时或更长时间。
15. 用小离心机在 4℃ 离心 15 分钟以沉淀 DNA。
16. 小心去掉上清并加 1.0 ml 70% 乙醇洗涤沉淀物，离心 5 分钟。
17. 小心去掉乙醇，离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体并让乙醇挥发 5~10 分钟。
18. 根据测序方法的要求用 20~30 ul TE 或水重悬沉淀物。 展开 | 
