胞内晶体蛋白基因的酿酒酵母真核表达
实验概要
本实验将酿酒酵母作为胞内晶体蛋白的携带和表达宿主，同时，作为可能的营养体喂养海洋线虫P. redivivus将所表达的目的蛋白导入线虫机体，观察线虫的生长、发育、繁殖或是死亡情况，探讨胞内晶体蛋白对昆虫病原线虫以外的线虫是否具有营养作用。为此，首先构建一种重组大肠杆菌，其所携带的重组质粒能够在大肠杆菌细胞中复制，在酵母细胞中表达，即大肠杆菌－酿酒酵母穿梭载体。本实验采用了不带ATG起始位点的pYES2.1/V5-His-TOPO质粒，进行酿酒酵母重组载体的构建，研究非融合目的蛋白在酵母细胞中复制或表达的状况，为利用该重组酿酒酵母作为饵料饲养海洋线虫P. redivivus提供材料。
主要试剂
1. 主要试剂(盒)
1) pYES2.1 TOPO TA Expression Kit，美国Invitrogen公司；
2) S. c. EasyComp Transformation Kit，美国Invitrogen公司；
3)苄青霉素，AMERSCO进口分装，广州广州威佳生物技术公司；
4) PMSF，AMERSCO进口分装，广州广州威佳生物技术公司；
5) 葡萄糖、半乳糖，AMERSCO进口分装，广州博理生物科技公司；
6) 限制性内切酶BamH I、Xba I，大连宝生物工程公司；
7) 各类氨基酸，AMRESCO进口分装，广州博理生物科技有限公司；
8) YNB（Yeast Nitrogen Base），酵母氮碱，Bebco公司；
9) 低分子量蛋白质标准（14.4 kD～94.0 kD，5 bands），北京天为时代科技有限公司；
10) 酸洗玻璃珠，美国Sigma公司。
11) 其他试剂为国产分析纯。
2. 培养基与常用溶液
1) YPD培养基
酵母提取物 10 g
蛋白胨 20 g
溶于900 mL水中，高压灭菌20 min，冷却后，加入100 mL无菌的20％葡萄糖储存液。室温下可保存两个月。
2) YPDA培养基
酵母提取物 10 g
蛋白胨 20 g
琼脂粉 20 g
加入到900 mL去离子水中，高压灭菌20 min后，冷却到50℃，加入100 mL无菌20％葡萄糖储存液，倒平板。4℃下可保存一个月。
3) SC-U筛选培养基
酵母氮碱 6.7 g
省却混合物 1.15 g
溶于900 mL水中，高压灭菌20 min，冷却后，加入100 mL无菌20％葡萄糖储存液，室温下可保存两个月。配制固体培养基时添加琼脂粉20 g。
4) 诱导表达培养基
酵母氮碱 6.7 g
省却混合物 1.15 g
溶于900 mL去离子水中，高压灭菌20 min，冷却至50℃后加入100 mL无菌的20％半乳糖储存液。
5) 20％葡萄糖储存液（10×），称取200 g葡萄糖，溶于800 mL双蒸水水中，定容至1000 mL，高压灭菌15 min或过滤除菌。4℃下可保存一年。
6) 20％半乳糖储存液（10×），称取20 g半乳糖，溶于80 mL去离子水中，定容至100 mL，过滤除菌，4℃保存。
7) 氨苄青霉素储存液（100 mg/mL），称取氨苄青霉素1 g，溶于10 mL水中，过滤灭菌，分装贮存于-20℃；
8) TENS缓冲液（10 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，0.5％SDS，pH 8.0），分别量取5 mol/L NaCl溶液0.2 mL，1 mol/L Tirs溶液（pH 8.0）2 mL，0.5 mol/L EDTA 0.2 mL，10％SDS 5 mL，补水定容至100 mL，室温保存；
9) PMSF储存液（100 mmol/L），称取PMSF 174 mg，以10 mL无水异丙醇溶解，分装后，-20℃保存。
10) 裂解缓冲液（50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，1 mmol/L EDTA，5％甘油，1 mmol/L PMSF，pH 7.4），分别配制1 mmol/L Na2HPO4溶液及1 mmol/L NaH2PO4溶液各100 mL，准确量取NaH2PO4溶液22.6 mL，Na2HPO4溶液77.4 mL，将二者充分混匀，以双蒸水稀释并定容至200 mL，高压灭菌15 min，室温保存。临用前，取适量磷酸缓冲液，加入EDTA（500 mmol/L）及PMSF（100 mmol/L）使其终浓度均为1 mmol/L，充分混匀，使用期间保持冰浴。
主要设备
1. MDF-192型超低温冰箱，日本三洋电机株式会社；
2. UV-2102 Pc型紫外分光光度计，UNICO（上海）仪器有限公司；
3. CF43S超净工作台，Gelman公司；
4. 高速冷冻台式离心机，Heraeus Sepatech公司；
5. Universal 32型台式冷冻离心机，德国Hettich公司；
6. Capsule HF-120型微量离心装置，Millipore公司；
7. THZ-C恒温振荡器，江苏省太仓市实验设备厂；
8. BL150S型电子天平，德国Sartorius公司；
9. GB 1302型天平，Mettler-Toledo仪器（上海）有限公司
10. C-90-1型电热恒温水浴锅，广州市越秀区医疗器械厂；
11. 微波炉，日本Sharp；
12. DYCD-31D型水平电泳槽，北京六一仪器厂；
13. DYCZ-24D型垂直电泳槽，北京六一仪器厂；
14. DYCZ-40A型转印槽，北京六一仪器厂；
15. EPS1001型电泳电源，Amersham Pharmacia公司；
16. 连续可调微量移液器，德国Eppendorf公司；
17. Delta-320-S型pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；
18. Primus 25型PCR基因扩增仪，德国MWG公司；
19. AlphaImager 2200型凝胶图像分析系统，Alpha Innotech公司；
20. XK96-B微型旋涡混合仪，江苏省姜堰市新康仪器厂；
21.85-2型恒温磁力搅拌器，上海仪表（集团）供销公司；
22. TY-B型多用脱色摇床，上海市新波无线电厂；
23. DEM-III型自动酶标洗板机，北京拓普分析仪器有限责任公司；
24. PVDF膜，美国Millipore公司；
25. Model 550型酶标仪，美国BioRad公司。
实验材料
1. 重组供载体pCR4-TOPO-cipA及pCR4-TOPO-cipB；
2. 酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TOPO，美国Invitrogen公司；
3. 大肠杆菌Escherichia. coli TOP10F’，美国Invitrogen公司；
4. 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1。
实验步骤
1. 重组穿梭载体的构建
按照质粒提取方法提取保存有目的基因cipA及cipB的供载体pCR4-TOPO-cipA及pCR4-TOPO-cipB，以此为模板，分别扩增获得cipA及cipB基因片段。
1) 目的片段与表达载体的连接
在洁净的0.2 mL PCR管中依次加入下列组分：
cipA或cipB的PCR产物 4 µL
盐溶液 1 µL
TOPO载体（pYES2.1/V5-His-TOPO） 1 µL
总体积 6 µL
轻混反应物，室温（20℃～23℃）下培养30 min，直接取2 µL用于随后的转化实验或于-20℃保存备用。
2) 大肠杆菌的转化及转化子的筛选
转化cipA或cipB基因与pYES2.1/V5-His-TOPO载体的连接产物到大肠杆菌TOP10F’感受态细胞中，转化后的细胞于LB（100 µg/mL ampicillin）抗性平板上培养。
以菌落PCR方法对长出的转化子进行快速筛选：
A. 对每个待测转化子，以原扩增引物为PCR引物，建立以下PCR反应体系进行筛选：
其中引物序列V5C-term rev：5’-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3’
10×PCR buffer | 2.5 µL | ||
dNTP Mix (10 mmol/L) | 0.5 µL | ||
cipA(B)-for (20 µmol/L) | 0.5 µL | ||
V5C-term rev (10 µmol/L) | 1 µL | ||
ddH2O | 20.3 µL | ||
Taq DNA Polymerase | 0.2 µL | ||
Total volume | 25 µL |
B. 在转化板上用无菌牙签随机挑取10个菌落，分别悬浮于上述两种反应混合物中，挑取菌落的同时注意该菌落的保种并编号。
C. 按以下程序进行PCR扩增，第一步，94℃ 10 min，使菌体裂解，核酸酶失活；第二步，按下列参数重复30个循环，94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min；第三步，72℃延伸10 min；
D. 扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳检测，在合适大小处出现特异性扩增条带的样品即为阳性克隆。
3) 重组表达载体的鉴定
挑取经初步鉴定的大肠杆菌转化子，于3 mL LB抗性液体培养基中少量增殖，使用QIAprep Spin Miniprep Kit提取质粒，分别进行PCR及酶切鉴定。
A. 重组质粒的PCR鉴定
B. 重组质粒的酶切鉴定
分别建立以下少量单、双酶切反应体系进行酶切鉴定：
单酶切体系 双酶切体系
ddH2O | 13 µL | |||||||
ddH2O | 11.5 µL | Buffer K (10×) | 1 µL | |||||
Buffer K (10×) | 2 µL | BamH I (15 U/µL) | 0.5 µL | |||||
BamH I (15 U/µL) | 0.5 µL | Xba I (15 U/µL) | 0.5 µL | |||||
质粒DNA | 5 µL | 质粒DNA | 5 µL | |||||
Total volume | 20 µL | Total volume | 20 µL |
轻弹管壁，使反应物混匀，37℃温育3 h。取3 µL酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，在条带大小与预计相符合的样品即为有目标片段插入并且方向正确的重组质粒。
提取后的质粒DNA按照2.4.3方法确定其纯度和浓度，必要时可根据2.4.4方法进行浓缩提纯，使DNA浓度在0.2 µg/µL以上，以保证酵母的转化率。
2. 酵母的转化
1) 酵母感受态细胞的制备
按照S. c. EasyComp Transformation Kit说明书的方法。
A. 在YPDA平板上划线培养INVSc1菌株，挑取单菌落，接种于10 mL YPD培养基中，30℃，250～300 r/min振荡培养过夜；
B. 测定培养物的OD600值，以无菌YPD稀释培养物，获得10 mL OD600＝0.2～0.4的稀释液；
C. 将稀释后菌液继续振荡培养至OD600＝0.6～1.0，约需要3～6 h；
D. 室温下，离心收集菌体（1500 r/min，5 min），重悬于10 mL Solution I中；
E. 再次离心，弃尽上清，菌体沉淀重悬于1 mL Solution II中；
F. 将制备的感受态细胞分装为50 µL/管，直接用于转化或-80℃保存备用。
2) 重组载体对酵母的转化
A. 室温下融化一管酵母感受态细胞，加入1 µg重组质粒，轻轻混匀，注意加入DNA溶液的体积不要超过5 µL；
B. 加入500 µL Solution III到DNA/细胞混合物中，充分混匀；
C. 将混合物30℃温育1 h，每个15 min摇匀一次，以提高转化效率；
D. 取25～100 µL菌液涂布到尿嘧啶营养缺陷型平板（SC-U）上，30℃倒置培养48 h。
3. 重组酵母转化子的筛选
1) 挑取转化的酵母单菌落，于2 mL SC-U选择培养基中，30℃振荡培养过夜；
2) 吸取1.5 mL过夜培养物到洁净离心管中，室温高速（12000 r/min）离心5 sec，弃上清；
3) 沉淀充分悬浮于100 µL TENS缓冲液中，加入约0.1 g酸洗玻璃珠，振荡器上充分振荡；
4) 细胞经液氮速冻后，沸水速融，振荡器上剧烈振荡30 sec，反复操作5次以上，使细胞破壁；
5) 加入200 µL TENS溶液，混匀，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡器上剧烈振荡2 min；
6) 12000 r/min，4℃离心10 min，吸取上清；
7) 加入1/10体积的NaAc（3 mol/L，pH 5.2），混匀；
8) 加入两倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后，12000 r/min，4℃离心10 min，弃上清；
9) 加入70％预冷的乙醇漂洗沉淀一次，离心弃上清；
10) 风干沉淀，溶于40 µL TE溶液中；
11) 取1～3 µL作为DNA模板进行PCR反应，反应参数与4.4.1.2中的PCR反应体系相同。1％琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。
4. 重组质粒的稳定性
1) 将重组酵母接种于带有尿嘧啶的完全培养基YPD中，每隔48 h转接到新鲜培养基中，并保留少量转接样品；
2) 各个时段所取的样品稀释后，分别涂布于YPD非选择平板；
3) 待菌落长出后，随机挑取同一菌落分别点种于YPD非选择平板和SC-U选择平板中；
4) 30℃倒置培养，比较两平板菌落的生长情况。
5. 重组酵母的半乳糖诱导表达
1) 挑取经鉴定的重组酿酒酵母阳性克隆到15 mL SC-U液体培养基（2％葡萄糖为碳源）中，30℃，200 r/min培养过夜；
2) 测定过夜培养物的OD600值，并以此计算配制50 mL OD600＝0.4的细胞稀释液所需要的培养物的体积，计算公式为：
V = | (0.4/mL)(50mL) |
x/mL |
其中：V—需要的培养物体积
x—过夜培养物的OD600值
3) 取相应体积的培养物，离心（1500 g，4℃，5 min），收集细胞；
4) 以2 mL诱导培养基（2％半乳糖为碳源）洗涤细胞两次，2 mL诱导培养基重悬细胞，然后加到50 mL诱导培养基中，30℃振荡培养进行诱导表达；
5) 分别于0、4、8、12、16、24 h后取样测定其OD600值，同时吸取5 mL菌液；
6) 离心（1500 g，4℃，5 min），弃上清，将菌体细胞重悬于500 µL无菌水中；
7) 转移细胞悬液至一洁净无菌离心管，高速离心30 sec，弃尽上清；
8) 菌体沉淀于-80℃保存备用。
6. 表达产物分析
1) 表达产物的SDS-PAGE分析
A. 取出保存的重组酵母细胞，冰上解冻，加入500 µL裂解缓冲液，充分悬浮；
B. 离心（1500 g，4℃，5 min），弃上清；
C.将沉淀重悬于裂解缓冲液中，获得悬浮液的OD600值为50～100（根据取样时所测定菌液的OD600值计算加入裂解液的量）；
D. 加入等体积的酸洗玻璃珠，剧烈振荡30 sec后，置于冰上30 sec，反复冻融并剧烈振荡，重复操作5次以上，显微镜下检查细胞破碎情况；
高速离心10 min，移取上清至另一洁净离心管中，并补充相等体积的双蒸水至原管振荡混匀，分别加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃加热2 min，分别作为胞内可溶及不可溶组分（煮沸后吸尽液体至另一洁净离心管中）-20℃保存，以便后续的分析；或在破壁后，直接加入与第3步中与裂解缓冲液等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀，100℃加热2 min，吸尽液体至另一洁净离心管中，作为胞内总组分-20℃保存。
E. 取5 µL上样，进行SDS-PAGE电泳（5%浓缩胶，15％分离胶，恒压160 V）
F. 考马斯亮兰染色，电泳脱色液脱色后，使用凝胶成像系统照相。
2) Western blot印迹分析
以CipA及CipB蛋白的特异性抗血清为免疫反应一抗，碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为免疫反应二抗，进行重组酵母表达蛋白的Western blot印迹分析(方法略)。
