赤点石斑鱼神经坏死病毒核酸检测试剂盒使用说明
赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV) 核酸检测试剂盒（一管式恒温荧光法）使用说明
赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV) 核酸检测试剂盒（一管式恒温荧光法）
产品说明
动物疫病检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、动物组织等样品中病毒的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于对赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV)的检测，检出限为103copies/μl基因组RNA。
◆ 产品组成（96测试）
032031LⅢ | |
试剂 | 含量 |
A-RGNNV-I | 22μL× 96管 |
B-I | 90 μL × 2支 |
R-I | 12 μL × 2支 |
NG-I | 50 μL × 3支 |
PG-RGNNV-I | 50 μL × 2支 |
◆ 适用仪器
Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C等恒温荧光检测仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光PCR仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②冰盒；③移液器（0.1-2.5μL，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；④离心机；⑤涡旋混匀器；⑥金属浴
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：模板添加区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
★分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照相关标准处理样品，制备的样本保存待用。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
建议使用配套水生动物病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。
2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）
取出所需测试数的已含有反应液的PCR管，将试剂完全解冻，解冻后打开管盖向各管管底分别加入0.8 μL B-I及0.2μL R-I，盖上管盖离心1 min。打开管盖分别沿各管管壁上加入2μL模板，顺序为NG-I、待测样品模板、PG- RGNNV -I。盖好PCR管盖后，离心3 min，立即进行PCR扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
①恒温仪器63℃条件下反应45 min。
②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃ 15 s，63℃ 45 s作为一个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，45个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
◆ 结果判定
①仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV)；若显示“阴性”，则样品中不含有对赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV)或含量低于检出限。如在40min~45min间出现曲线上扬而自动判读结果为阴性，可能由于样品含量较低导致，建议对样品进行富集或延长反应时间至60min进行复核。
②在荧光定量PCR仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV)；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV)或含量低于检测限。
NG反应管结果显示“阴性”，PG反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。
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