18S 基因核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）使用说明
物种鉴定系列
真核生物 18S 基因核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
请于-20℃条件下保存，有效期 12 个月
◆ 产品说明
物种鉴定系列可针对食品、饲料等样品中动物源性成分的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲
线判定结果。本产品用于真核生物的检测，检出限为 0.1%。
◆ 产品组成（48 测试）
021092M | |
试剂 | 含量 |
A-18S-P | 1000μL ×1 支 |
NG-P | 100μL ×1 支 |
PG-18S-P | 100μL ×1 支 |
◆ 适用仪器
荧光 PCR 仪（ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600）等 PCR 扩增仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌 1.5mL 或 2.0mL 离心管；②灭菌 0.2mL PCR 管或八联管；③冰盒；④移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：试剂准备区。
2）第二区：样本制备区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《SN/T 3730-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》或其他标准处理样品，制备的样本保存待用。样品的采集和制备是动物源性鉴别的重要步骤，为防止交叉污染，应使用一次性消耗品，研钵应经 160℃干烤
2 h，其他不宜干烤或高压处理的器皿应使用 1%次氯酸钠溶液浸泡。
取样应尽量采取肌肉组织，对于同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，提取 DNA。
采样过程应快速完成，将采取的样品迅速放入组织搅碎机中进行均质成糜状，充分混匀，取 0.1 g 充分混匀的样品，采用液氮研磨或均质器均质。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
将试剂完全解冻，各组分离心 30s。
1.试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）：
若有 N 个待检样品，则参照下表，按照 N+2 个数量计算反应液用量（N 个待检样品+1 个阴性对照+1 个阳性对照），涡旋混匀，离心 30s，分装于 0.2mL PCR 管中。
试剂 | 使用量 |
A-18S-P | 20×(N+2)μL |
反应液总体积 | 20×(N+2)μL |
2．模板制备（样本制备区）
建议使用试剂配套动物源性成分 DNA 提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
3．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
在步骤 1 中已含有反应液的 PCR 管中加入 5μL 模板，顺序为 NG-P、待测样品模板、PG-18S-P。涡旋混匀 30s，离心 1min，立即进行 PCR 扩增反应。
扩增反应（扩增及产物检测区）
使用荧光定量 PCR 仪，荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 TAMRA。按下列条件设置扩增反应：
PCR 循环 | 荧光收集位点 | |||||||
95℃ | 10 分钟 | 1 个循环 | — | |||||
95℃ | 15 秒 | 40 个循环 | — | |||||
60℃ | 1 分钟 | ※ |
5.基线和阈值设定基线调整取 3-15 个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点
◆ 结果判定
检测样品无 Ct 值，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有真核生物或含量低于检测限；
检测样品 Ct≤35，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有真核生物；检测样品 Ct＞35，可直接报告样品阴性，不含有真核生物或含量低于检测限。
NG 反应为平滑直线，PG 反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。
