分子生物学相关实验步骤及注意事项（三）qPCR篇
——荧光定量PCR篇——
实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
（一）荧光阈值和CT值
荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
CT值是指PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
CT值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，公式如下：Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
（二）荧光探针和荧光染料
荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。
SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。SYBR Green I 用于qPCR无需探针，设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以鉴定有无PCR杂带、引物二聚体等。但是SYBR Green I 无模板特异性，因此会引起假阳性而影响定量的精确性。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对，特异性更高。
（三）qPCR注意事项
1. 用于qPCR反应的RNA应避免DNA的污染，RNA提取和反转过程中应小心谨慎。
2. 操作过程中避光，冰上操作。
3. cDNA模板避免反复冻融，否则会引起模板的降解。
4. 模板量不足或降解将导致CT值出现过晚或者不出现。对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。
5. 加入模板时应先进行适度稀释，再加入反应体系中，提高扩增效率。但模板浓度过低导致重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
6. 引物设计时，扩增片段不宜太长，一般在80-300bp均可；退火温度要高，一般要在 60℃以上。并且要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
7. 体系中引物浓度过高或者引物二聚体均会引起溶解曲线不止出现一个主峰。
8. 设置阴性对照，防止水和mix被污染。
