LaVision双光子显微镜-呼吸道网络中的神经元活动
Glycinergic interneurons are functionally integrated into the inspiratory network of mouse medullary slices
Stefan M. Winter & Jens Fresemann & Christian Schnell & Yoshitaka Oku & Johannes Hirrlinger & Swen Hülsman
摘要：呼吸道网络中的神经元活动功能性地依赖于抑制性突触传递。我们使用双光子显微镜分析了独立吸气“pre-Bötzinger”复合物驱动网络的节律性切片。通过在吸气相关的呼吸过程中分别升高或降低细胞溶质内自由钙离子的浓度，我们识别出吸气（96%）和“紧张性”呼气（4%）神经元。而且，在GlyT2启动子控制下表达EGFP的BAC转基因的小鼠中，钙离子成像的50%的吸气神经元被甘氨酸化。切片中甘氨酸化神经元的吸气过程通过整个细胞记录的形式确认。我们同样发现了接受来自其它甘氨酸化神经元相位抑制的甘氨酸化神经元。我们的钙离子数据表明在节律性切片中的“pre-Bötzinger”复合物驱动网络中的甘氨酸化神经元包含了大量的吸气神经元。
材料与方法
实验动物
野生型和在甘氨酸化神经元中表达绿色荧光蛋白EGFP的BAC（GlyT2-EGFP）转基因小鼠被饲养在大学医院Göttingen的动物饲养设施中，并按照德国生理学会、lower saxony州和德意志联邦共和国的相关指导进行喂养。野生型和BAC（GlyT2-EGFP）转基因型小鼠被用于制备双光子激发显微镜切片，只有BAC（GlyT2-EGFP）转基因小鼠被用于完整细胞记录和免疫组织化学研究。
双光子激发显微镜的钙离子成像
腹侧呼吸列的钙离子成像由基于商业扫描头（TriM Scope，LaVision BioTec，Bielefeld，Germany）的用户定制的双光子显微镜实现。在这个扫描头中，脉冲红外激光束可以被分解为高达64个一连串的焦点，在没有增加光损伤的同时增加单位时间内发射荧光的数量。扫描头被安装在一个固定载物台的正置显微镜(Axioscope FS2, Zeiss, Oberkochen, Germany)上，使用X40（0.8NA）或X63（1.0NA）的水浸物镜(Zeiss, Oberkochen, Germany)。双光子激发通过一个装配了宽带光学器件的Ti：Sa激光器(MaiTai BB, Spectra Physics, Darmstadt, Germany)获得。对于释放荧光的场检测，我们使用CCD相机(Ixon 885 Andor Technology, Belfast, Northern Ireland, or PCO; Sensicam QE; Kehlheim, Germany) 快速钙离子成像我们使用多束激光模式(16 或32 束)，扫描场为200 X 200μm (Ixon camera) or 170 X 220μm (Sensicam QE)。曝光时间为25–40 ms (4×4 binning=255×256 pixel) ，采样频率为10 到 30 Hz. 为了获取更高的分辨率，激发光束增加到64束，以长积分时间的非像素联合模式成像。激光能量用扫描头中的半波板和偏振层板控制，以“ImSpector”成像软件(LaVision BioTec, Bielefeld, Germany)控制, 10μm 步长的3D堆栈使用一个piezo-focus (Physik Instrumente, Karlsruhe, Germany)来确定深达100μm的呼吸神经元的空间分布。 组织更深处的细胞无法确认边界。显微镜也装配了两个光电倍增器(Hamamatsu Photonics, Hamamatsu,Japan)用于非扫描荧光检测，用于高分辨率扫描和1μm的z轴堆栈 (Fig. 2).
主要结果
Fig. 1节律性切片中呼吸神经元的双光子激发显微图像。
A由多焦点双光子激发显微镜观察到的俄勒冈绿BAPTA1-AM (OGB-1-AM) 标记的位于腹侧呼吸列中的神经元。b.一次较大的呼吸活动：ΔF图像在C中型号标记的时刻获取，展示了5个神经元细胞（箭头处）中的钙离子浓度变化（橙色）。c 同时记录了群场势能(∫)和细胞内自由细胞溶质钙离子瞬变。C中的跟踪曲线表示了来自5个呼吸神经元（a、b中箭头处）的钙离子变化(ΔF/F0)。d.俄勒冈绿BAPTA1-AM标记的呼吸神经元。e. 交叉区域(CC)呼吸神经元钙离子信号的假彩图。红色表示吸气神经元 (CC>0.8)，蓝色表示一个呼气神经元的吸气抑制 (CC<−0.3)。f.d和e中表明的三个神经元钙离子变化(ΔF/F0)及场势能(∫)的同步记录
g循环触发的十次连续呼吸活动的与f中数据同样的平均值
Fig. 2 延髓尾段中EGFP标记的甘氨酸化神经元的分布
a–c 概观了BAC(GlyT2-EGFP)-小鼠EGFP标记的甘氨酸化神经元 (a) 和延髓尾段中胆碱乙酰转移酶(ChAT)的表达 (b). ChAT抗体使用Cy5结合的荧光二抗通过共聚焦激光扫描显微镜检测。C中显示了两个通道的叠加。
d–f通过高水平CHAT表达确认的疑核区域放大。 (e).疑核致密部发现的非甘氨酸化神经元. f.d和e的叠加，揭示CHAT阳性神经元中没有EGFP的表达。XII舌下神经核，IO下橄榄体，10N迷走神经背核，AMB 疑核。g.这一版显示了甘氨酸化神经元的形态。82幅图像合成的最大密度投影，来自于双光子激发显微镜扫描（步长1um）
Fig. 3 甘氨酸化神经元中节律性钙离子瞬变。a 通过双光子在900nm激发，以带有CFP优化滤波器(465–495 nm)的CCD检测，确认GlyT2-EGFP神经元（箭头）b 通过使用800nm激发波长和一个501–551 nm发光带通滤波器显示和测量的 OGB-1-AM荧光.所有的GlyT2-EGFP 细胞 (a) 都被OGB-1-AM (b)标记. c 从甘氨酸化神经元细胞记录的胞内自由细胞溶质钙离子瞬变。跟踪曲线的条数相应于图像a和b中神经元的个数。下面的跟踪曲线(∫)显示的是来自preBötC的积分的群场势能。d 实验的图像综合。左轴（白色）显示吸气EGFP表达的甘氨酸化神经元（占总甘氨酸化神经元）的比例，右轴（黑色）显示的是吸气甘氨酸化神经元（占总吸气神经元）的比例。数据基于5张切片的20幅图像，以mean±SEM 的形式给出。
