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重组质粒的连接、转化及筛选

2020.9.08

材料、设备及试剂
　　一、材料
　　外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。
　　二、设备
　　恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。

　　三、试剂
　　1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L ATP（过滤灭菌）。
　　2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
　　3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
　　4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
　　5、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。
　操作步骤
　　一、连接反应
　　1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。
　　2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。
　　3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。
　　4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。
　　同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。
　　二、 E. coli DH5α感受态细胞转化
　　1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
　　2、加入连接产物溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
　　3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
　　4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
　　5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
　　同时做两个对照:
　　对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
　　对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

　　统计每个培养皿中的菌落数。
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
　　[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
　　三、重组质粒的筛选
　　1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
　　2、倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
　　3、放于4℃数小时,使显色完全（此步LB培养基不做）。
　　不带有T-vectorDNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有T-vector的空载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落；带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG培养基上为白色菌落。
　　四、酶切鉴定重组质粒
　　用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳，同时以煮沸法抽提的T-vector做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较T-vector慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。
　　[注意] 1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。
　　2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。
　　3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
　　4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。
　　5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。
　　6、LB选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。
　　7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。
　　8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。