分子生物学常用实验技术（一）
第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定
第二章DNA 酶切及凝胶电泳
第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
第四章RNA 的提取和cDNA 合成
第五章重组质粒的连接、转化及筛选
第六章基因组DNA 的提取
第七章RFLP 和RAPD 技术
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
第九章分子杂交技术
第十章测序技术
第一章质粒DNA 的分离、纯化和鉴定
第一节概述
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb
不等,为双链、闭环的DNA
分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F
质粒(又称F 因子或性质粒)、R 质粒(抗药性因子)和Col 质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent
control)和松驰控制型(Relaxedcontrol)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1
个或几个质粒分子,如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20 个以上,如Col E1
质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA
复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20 多个扩增至1000-3000 个,此时质粒DNA
占总DNA 的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。
质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA
序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA
片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如PBR322、PUC 系列、PGEM
系列和pBluescript（简称pBS）等。
从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3
个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton
X-100 可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS 或Triton X-100 处理后,细菌染色体DNA
会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA
比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA
变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed
circularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA
片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA 双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA
外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA
两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA,
简称ocDNA)；如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNA
其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
第二节材料、设备及试剂
一、材料
含pBS 的E. coli DH5α或JM 系列菌株，1.5ml 塑料离心管(又称eppendorf 管),离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
三、试剂
1、LB
液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl
10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调pH 至7.5, 加去离子水至总体积1 升,高压下蒸气灭菌20 分钟。
2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加12g 琼脂粉,高压灭菌。
3、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。
4、溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。
5、3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解40.81g NaAc?3H2 O,用冰醋酸调pH 至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15 分钟,储存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH 母液稀释)，1％ SDS。
8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
9、RNA
酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L Tris?Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl
中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15 分钟,使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf
管分装成小份保存于-20℃。
10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA
和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris?Cl
(pH8.0)和0.1mol/L Tris?Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH 值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA
会分配于有机相。
11、氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1 混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
12、TE 缓冲液：10 mmo/L Tris?Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% TritonX-100。
14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
15、电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液(5×)：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。（2）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
