动物细胞/组织培养常见的一些问题（二）
13.离心动物细胞的离心速率：
回收动物细胞，离心速率一般为300g，5 - 10 分钟，离心强度过大将造成细胞破裂死亡。
14.细胞生长缓慢：
1）换用了不同的培养基或血清，解决方法是可比较不同培养基成分，用生长实验比较以前批次和新批次的血清， 提高接种细胞数，使细胞逐步适应新的培养基 。
2）L-谷氨酸等促进细胞生长的成分没加入，用尽或分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex）替代L-谷氨酸
3）支原体污染或低水平细菌或真菌污染
4）培养试剂保存不当
5）接种细胞数太少
6）细胞传代次数太多
7）细胞传代时密度太高，应在细胞铺满前的指数生长期传代
15.细胞死亡：
1）培养箱中无CO2，检查管子有无泄漏，是否需更换CO2罐，尽量减少开关培养箱的次数
2）培养箱温度不恒定
3）抗真菌剂或抗生素浓度过高，对细胞产生毒性
4）细胞在冻存或解冻过程中被破坏
5）培养基中渗透压不正确
6）培养基中积累了有毒的代谢产物
16.细胞冷冻培养基的成份：
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95
%原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，所以不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
17.DMSO的等级及使用和保存：
冷冻保存使用之DMSO 等级必须为Tissue culture grade的DMSO (如Sigma
D2650)。其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C。避免反复冻融造成DMSO
裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。
18.冻存液中的甘油的保存：
要避光保存，见光后甘油转化为对细胞有毒性的丙烯醛。
19.细胞欲冷冻保存时注意事项：
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml为宜。实际操作时，建议按照细胞生产商建议的细胞密度冻存。冻存传代次数低的细胞。
20.冷冻保存细胞之方法：
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30-60 分钟→ （-20℃ 30 分钟）→ -80℃16-18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase长期储存，如细胞浸在液氮中，有可能被液氮中的微生物污染。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡。也可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，但存活率降低。
21.细胞解冻：
快速解冻，将37oC预热的培养基逐滴加入解冻的细胞。
22.支原体污染、检测及处理：
支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2um，可通过滤器。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA
的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。
目前，支原体检测的方法有以下几种。（a）相差显微镜观察；（b）低张处理地衣红染色法； （c）荧光染色法；（d）酶标法；
（e）PCR法：这是常用的一种简便的检测方法。 此方法灵敏度高，检测耗时短，样品量小（只需50ul细胞培养用液上清），但引物及制剂费用较高。
支原体污染的处理：1）丢弃细胞，培养基及其他培养用试剂 2）重新获取未污染细胞，新鲜培养基和试剂。
