显微分光光度术概述
显微分光光度术（microspectrophotometry，
MSP）实质上是显微镜技术和分光光度技术的结合。它以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测量基础，可以对细胞内的某些重要的生物分子（如
DNA、RNA、蛋白质等）的含量进行定量测试，是组织化学和细胞生物学中定量研究的必不可少的工具。
显微分光光度计由主控计算机、多功能显微镜、透射和落射光源、单色仪、高精度扫描台和光电倍增管等构成。常用测量方法有显微荧光光度术（Microfluorometry）、显微密度术（Microdensitometry）、细胞光度术（Cytophotometry）显微反射光度测量及波长扫描测量等。与通常的生化定量方法相比，用显微光度术测定物质含量的主要优点是所用材料少，在同一涂片上测得多个参数；结合形态学特点，可选择测定单个细胞或细胞器内的多种物质及细胞的代谢产物，同时可将测量光栏定位于细胞的某一部位或细胞器中；整个测量不需复杂的纯化过程，能在短时内测得结果，便于观察药物作用对细胞活性改变的影响
（一）显微吸收光度术测量
显微吸收光度法时一种光度测量的化学方法，它基于细胞内的蛋白质、多糖、核酸、脂类和酶染颗粒能在不同等电点下电离出不同侧基，因而造成对染料亲和力不同，应用不同的化学试剂染色，可使不同的细胞组分染上不同的颜色，在显微镜下成为可见的结构。染料于组分的结合必须是特异性的，即染料、细胞组分结合物的光吸收是遵循朗伯-比尔定律，而且染色深浅与被染细胞组分之间呈化学剂量学关系，符合这两者关系的样本就可应用吸收测量法，通过光检测器（可使光能变成电能）测量有色化合物吸收单色光的量。
当光束通过固体液体或气体介质时，常有部分光被吸收转换成其他形式的能量。物质的光吸收和光波长有关，其吸收能力可通过测定入射光经测量区域的前后光强度换算出光密度来定量分析，它的吸收特性必须遵循朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。
朗伯-比尔定律规定，当单色的平行光通过均匀溶液时，溶液的吸收能力和溶液的路程长度及溶质浓度成正比。可通过消光度A来确定。
A=-lgT=lgIo/I=K·C·L
式中T为溶液透光率，Io和I分别为入射光强和透射光强，K为吸收常数，C为吸光溶质浓度，L为光程。
由于光强度比较容易测量，经单色仪或干涉滤光片能得到单色光，显微镜近轴区的照射光近似于平行光，所以凡在涂片切片中含有吸光特性的物质,理论上均可采用吸收光度法测量。动植物中许多天然有色物质如肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素c等，可用吸收光度法测含量；组织化学法染色的完整细胞的涂片如DNA的福尔根染色，可用该方法测量胞核DNA相对含量；还可用该法进行各类酶标的定量测量，对蛋白质进行干扰校正后在天然吸收基础上测定核酸含量。
显微吸收光度测量需满足朗伯-比尔定律条件，待测物质需为均质，但生物学物质很少是均质的，而且显微镜成像过程中，经过光路系统各界面多次折射反射后会导致测量中的分布误差、闪烁误差、系统误差等，影响测量精度。所以除校正系统至最佳状态外，常用双波长法、一波二区法和扫描法来消除误差。扫描法是最令人满意的方法。测量时，先将待测物分成大量小区域，近似认为每个小区域内物质分布为均质，采用顺序逐点扫描法测出各小区域的消光度，经积分后换算出待测物的总消光度，求得其相对含量。扫描法根据不同扫描方式可分为：飞点扫描、像扫描、物扫描、TV扫描等。在实际测量时，台物扫描是最常用的方法，在高精度扫描台上放好样品，确定其扫描范围和波长，根据放大倍数确定测量光栏的大小，根据待测物确定单色入射光波长，选取全自动扫描后由计算机数据处理并显示结果及扫描图形。台物在x方向和y方向上来回移动，而测量光栏位置不动，使台上的被测物质各小区域依序进入测量光栏内而被测量；也可用影象扫描，台物不动，测量光栏的象在台物上沿x方向和y方向来回移动，扫描测量重复性好，准确性和灵敏度高，测量精度可达10-9g，可方便地进行细胞内细微结构的分析，区分不同细胞类型的差别。
（二）显微荧光光度测量
定量显微荧光光度测量是组织化学和细胞化学中的另一种重要技术，可通过测试固定组织细胞内的荧光反应物来对生物学标本进行定量分析。荧光种类有物质的自发荧光或是用荧光染料对某些生物学物质作特选染色后产生的继光荧光。
与吸收光度测量相比，显微荧光光度测量有许多明显的优点。一般荧光测量所用染料浓度远比吸收法低，甚至可低10000倍，尤其在背景足够暗时可对低浓度荧光物质高度敏感，可测量细胞内分散的微小颗粒。荧光物质本身是自发光体，无论测量孔径内物体形状规则与否，物质分布均匀与否，物体辐射的光量子在光电倍增管上都产生同样的效应，所以无需扫描测量就可避免分布误差。通过选取适当的激发波长和发射波长的谱线和宽度，可以做到高特异性的测量，通常显微分光光度计选用适当的窄带滤色片来获取所需荧光波长，高精度的显微分光光度计采用光栅单色仪，可获得5nm带宽的激发波长和检测波长。荧光光度荧光测量方法分有堵塞法和扫描光度法，测量多数采用堵塞法，选取足够大的测量光栏对待测物作总体荧光量测定，样品由计算机定位，可快速测量，适于大样本分析。荧光光度测量缺点是：荧光易衰减，有漂白作用，有时会猝灭，还必须减去本底荧光值。因此测量时要提高信噪比，必须掌握适当的激发时间和合适的荧光标准。
