薄层色谱法的试验步骤详解
薄层板制备
除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2～0.3mm)，取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度(可通过透射光和反射光检视)。
手工制板一般分不含粘合剂的软板和含粘合剂的硬板俩种。
常用吸附剂的基本情况：颗粒的大小，太大洗脱剂流速快分离效果不好，太细溶液流速太慢。一般说来吸附性强的颗粒稍大，吸附性弱的颗粒稍小。氧化铝一般在100-150目。氧化铝分为碱性氧化铝，适用于碳氢化合物、生物碱及碱性化合物的分离，一般适用于PH为9-10的环境。中性氧化铝适用于醛、酮、醌、酯等PH约为7.5的中性物质的分离。酸性氧化铝适用于PH4~4.5的酸性有机酸类的分离。氧化铝、硅胶根据活性分为五个级，一级活性最高，五级最低。
黏合剂及添加剂：为了使固定相(吸附剂)牢固地附着在载板上以增加薄层的机械强度，有利于操作，需要时在吸附剂中加入合适的黏合剂：有时为了特殊的分离或检出需要，要在固定相中加入某些添加剂。
薄层板的活化：硅胶板于105-110℃烘30分钟，氧化铝板于150-160℃烘4小时，可得活性的薄层板。
点样
点样方式：分为手动点样和自动点样。手动点样主要器具为微量毛细管、微量注射器等。自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。手动点样灵活方便，常用于各种TCL鉴别中，器具以微量毛细管最常用。仪器的自动点样准确性好，常用于薄层扫描法的含量测定。
点样方法：分为接触式点样和喷雾点样。喷雾点样为仪器控制，在此不展开描述。接触式手工点样时，应注意小心用点样器垂直接触薄层板表面以防止损伤板面。若薄层吸附剂表面被损坏或点成洼孔，则展开后斑点成不规则形状；靠近溶剂前沿的化合物形成三角形，靠近原点的化合物形成新月形，影响测定结果。原点损失带来误差，也将使展开后的定量和判断不准确。
点样应注意的问题：
(1)点样量：原点位置对样品容积的负荷量有限，体积不宜太大，一般为 0.5~10μl，样品的浓度通常为0.5~2mg，太浓时展开剂从原点外围绕行而不是通过整个原点把它带动向前，使斑点拖尾或重叠，降低分离效率。点样量太小，不能检出清晰的斑点影响判断。点样量太多，展开剂不能全部负载，容易产生拖尾现象。当点样量适合时，可采用点状点样；当点样量过大，原点无法负荷时，可采用条带状点样，得到更好的分离效果，提高分辨率。
(2)样品的溶剂：样品在溶剂中溶解度很大，原点将变成空心圆，影响随后的线性展开，所以原则上应选择对被测成分可以溶解但溶解度不是很大的溶剂。供试液的溶剂在原点残留会改变展开的选择性，亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分(特别在高湿度环境)对色谱质量也会产生影响，因此除去原点残存溶剂是必要的，但对遇热不稳定和易挥发的成分，应避免高温加热，以免成分被破坏或损失。
展开
展开剂也称溶剂系统，流动性或洗脱剂，是在平面色谱中用作流动相的液体。展开剂的主要任务是溶解被分离的物质，在吸附剂薄层上转移被分离物质，使各组分的Rf值在0.2~0.8之间并对被分离物质要有适当的选择性。作为展开剂的溶剂应满足以下要求：适当的纯度、适当的稳定性、低黏度 、线性分配等温线、很低或很高的蒸气压以及尽可能低的毒性。
展开剂的配制：配制展开剂时，应严格控制其比例准确度，如遇到比例很小的溶剂时，应尽量满足其精确度要求，而不是为图方便省事直接用滴管加入。展开剂配好后如果浑浊不清，不能立即使用。应转移入分液漏斗中，待其静置分层澄清后再取其上层(或下层)液进行展开。
展开剂的用量：展开剂的用量以薄层板放入的深度为距原点5mm为宜，切勿倒入过多，将原点浸入展开剂，成分将被展开剂溶解而不随展开剂在板上分离。
溶剂蒸气的作用：溶剂蒸气在薄层色谱中起着重要作用，它和液相(展开剂)、固定相(吸附剂)一起构成了一个作用机制复杂的三维层析过程。
溶剂的质量：展开剂中溶剂的质量直接影响薄层色谱分离能力。如果含有杂质超标、水分超标以及吸收空气中干扰气体等，均可影响分离结果。如甲酸乙酯遇水容易水解，如用多次开瓶的残存溶剂，因逐渐吸收大气中的水分而不同程度地分解，所得的色谱与用新鲜溶剂所得色谱有明显差别。展开剂展开后，溶剂比例发生变化，勿重复使用。
展开方式总的来讲平面色谱的展开有线性、环形及向心3种几何形式。
A 单次展开 用同一种展开剂一个方向展开一次，这种方式在平面色谱中应用最为广泛。(垂直上行展开，垂直下行展开，一向水平展开，对向水平展开)
B 多次展开 单向对此展开，用相同的展开剂沿同一方向进行相同距离的重复展开，直至分离满意，广泛应用于薄层色谱法
C 双向展开 用于成分较多、性质比较接近的难分离组分的分离。
薄层展开室需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中)，密封室盖，待展开至规定距离(一般为10～15cm)，取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。
影响展开的因素
A 相对湿度的影响
B溶剂蒸汽的影响(a 展开室的饱和b预吸附)
C 温度的影响
D 展距的影响与分离度仅正比与展距的平方根
显色
A 光学检出法
a自然光(400~800nm)
b紫外光(254nm或365nm)
c荧光一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在纸或薄层上显出不同颜色的荧光斑点(灵敏度高、专属性高)
B 蒸汽显色法
多数有机化合物吸附碘蒸气后显示不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况，前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利，但是制备薄层时要注意被分离的化合物是否改变了原来的性质。
C 物理显色法
用紫外照射分离后的纸或薄层后，使化合物产生光加成，光分解、光氧化还原及光异构等光化学反应，导致物质结构发生某些变化，如形成荧光发射功能团。发生荧光增强或淬灭及荧光物质的激发或发射波长发生移动等现象，从而提高了分析的灵敏度和选择性。
D 试剂显色法
广泛应用的定位方法。用于纸色谱的显色剂一般都适用于薄层色谱，还有防腐剂的显色剂不适合用于纸色谱及含有有机黏合剂薄层的显色，又时喷显色剂后续加热，这也不是用于纸色谱。
显色方法a喷雾显色：显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷洒在纸和薄层。b 浸渍显色：挥去展开剂的薄层板，垂直的插入盛有展开剂的浸渍槽中，设定浸板及抽出速度和规定在显色剂中浸渍的时间。
显色试剂
a 通用显色剂硫酸溶液(硫酸：水 1：1，硫酸：乙醇1：1)、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高锰酸钾溶液、碱性高锰酸钾溶液(还原性化合物在淡红色背景上显黄色斑点)
b 专属显色剂
⑸测定比移值
在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。
⑹ 薄层扫描
薄层扫描法指用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测层析谱。对于中成药复方制剂，亦可用相应的原药材按需要组合作阴、阳对照，然后比较其薄层扫描图谱加以鉴别。使用仪器为薄层扫描仪。
如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。
