评估SDS在MALDI-TOF MS直接鉴定阳性血培养样本中的应用价值
快速、准确鉴定血流感染病原菌是微生物实验室的一项重要工作。血培养报阳后传统的转种和生化表型鉴定方法至少需要48 h, 而通过对血培养阳性样本的前处理, 借助基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）可以快速得到细菌鉴定结果, 大大缩短报告时间, 从而满足临床快速诊断的需求。本研究通过对阳性血培养前处理方法改良前后的鉴定结果进行比较, 以寻求更高效的血培养直接鉴定方法。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 血培养阳性样本 收集2016年3— 9月复旦大学附属中山医院微生物室血培养阳性样本378份, 同一患者的不同血培养瓶均入选本研究。
1.1.2 试剂和仪器 BACTEC FX血培养系统和配套的树脂血培养瓶、溶血素血培养瓶、真菌血培养瓶及分离胶促凝管均购自美国BD公司。MALDI-TOF MS仪、α -氰基-4-羟基肉桂酸（alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid , CHCA）基质液、甲酸基质液、64孔靶板、MS细菌数据库（版本V2.0）及血琼脂平板购自法国生物梅里埃公司。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）、甲酸、乙腈、无水乙醇购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 方法
1.2.1 MALDI-TOF MS直接鉴定前处理 选择镜检阳性的血培养样本进行MALDI-TOF MS直接鉴定前处理, 镜检阴性的血培养样本则不再进行MALDI-TOF MS直接鉴定。
1.2.2 改良前的前处理方法 抽取5 mL阳性样本转入分离胶促凝管内, 以1 308× g低速离心10 min, 弃去上清, 将分离胶边缘灰白色沉淀物（菌体富集物）挑取后放入含300 μ L蒸馏水的Eppendorf管中, 加无水乙醇900 μ L, 混匀。以19 000× g高速离心2 min。彻底去除上清, 向沉淀物中加入70%甲酸50 μ L和100%乙腈50 μ L, 混匀。以19 000× g高速离心2 min。取上清1.5 μ L备用。
1.2.3 改良后的前处理方法 阳性血培养样本按照之前的方法先离心, 用1 000 μ L蒸馏水洗涤分离胶边缘的灰白色沉淀物, 并将菌悬液转移至 Eppendorf管中。以19 000× g高速离心2 min。弃去上清, 沉淀加0.1%SDS 1 000 μ L, 充分混匀、洗涤。以19 000× g高速离心2 min。弃去上清, 向沉淀物中加蒸馏水再次洗涤。高速离心后弃去上清, 将沉淀物溶于300 μ L蒸馏水和900 μ L无水乙醇中, 后续的步骤同前。
1.2.4 阳性血培养样本的常规转种与培养 挑取阳性血培养样本, 转种血琼脂平板, 置35 ℃、CO2环境中过夜培养。
1.2.5 MALDI-TOF MS鉴定 将标准菌株大肠埃希菌（ATCC 8739）（由法国生物梅里埃公司提供）涂在靶板的校准点位中, 挑取0.5~1个菌落涂在靶板的点位中, 取1.5 μ L已前处理的上清液（直接鉴定的样本）滴入靶板的点位中, 待干燥。镜检或培养为细菌者加1 μ L CHCA基质液; 镜检或培养为酵母者加0.5 μ L 甲酸基质液, 室温干燥后, 再加1 μ L CHCA基质液, 室温干燥。校准点位加1 μ L CHCA基质液, 干燥后放入MALDI-TOF MS仪, 仪器自动获取病原菌全细胞蛋白质谱, 将待测菌质谱与MS细菌数据库中的质谱进行比较、分析从而获得鉴定结果。本实验直接鉴定如出现与菌落鉴定不符合的结果, 以纯菌落MALDI-TOF MS的鉴定结果为最终结果。
1.3 统计学方法
使用SPSS 2.0软件进行统计分析, 率的比较采用χ 2检验, 以P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 未使用和使用SDS洗涤的样本的检测
未使用SDS洗涤的样本90例, 剔除3例纯菌落MALDI-TOF MS无结果的样本, 单种细菌感染的血样本83例, 种鉴定准确率为73.5%, 有4例为复数菌感染。使用SDS洗涤的样本288例, 剔除2例菌落MALDI-TOF MS无结果的样本, 单种细菌感染的血样本277例, 种鉴定准确率为82.7%, 有9例为复数菌感染。
2.2 未使用和使用SDS洗涤的样本各类病原菌的检测
使用SDS洗涤样本后MALDI-TOF MS对革兰阳性球菌和酵母的鉴定准确率有明显增加（P< 0.05）, 见表1。 改良后葡萄球菌的鉴定准确率从62.5%增加至95.6%, 链球菌的鉴定准确率从33.3%增加至90.0%, 一些少见菌如产气荚膜梭菌、纹带棒状杆菌和人苍白杆菌等都得到很好的鉴定, 见表2。
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2.3 复数菌的检测
本研究收集复数菌感染共13例。改良前4例, 有1例2种菌都得到鉴定结果, 还有1例只鉴定出一种病原菌, 另有2例无鉴定结果。改良后收集到9例复数菌感染的血样本, 有6例鉴定正确, 有3例只鉴定出1种病原菌, 鉴定准确率从25.0%增加至66.6%。见表3。
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3 讨论
MALDI-TOF MS是一种新兴的蛋白质组学检测技术, 是微生物鉴定的新技术, 因其具有快速、准确和操作简便等特点而在微生物实验室得到广泛应用。通过病原菌富集技术处理阳性血培养样本后直接用MALDI-TOF MS进行鉴定, 将会极大地提高鉴定速度, 缩短报告时间, 满足临床快速诊断的需求。
在阳性血培养样本直接鉴定中, 前处理是关键步骤, 对鉴定结果有直接影响。有文献显示目前富集菌体的前处理方法较多, 有分离胶促凝管法、滤膜吸附法和差速离心法等, 每种方法都有各自的特点, 亦有较好的鉴定效果。但限于某些研究方法需要添置特殊仪器或增加研究成本, 本研究使用了分离胶促凝管法的前处理方法, 该方法不需要另添置仪器, 操作也较为简便。
有文献显示, 使用分离胶促凝管法富集菌体鉴定对革兰阳性菌的鉴定准确率为60.0%~79.7%, 革兰阴性菌的鉴定准确率为86.6%~86.9%。也有在使用分离胶的基础上通过方法的改进使鉴定准确率增加的介绍。本研究未使用SDS洗涤的样本革兰阳性菌的鉴定准确率为65.7%, 革兰阴性杆菌为92.3%, 但在革兰阳性球菌中除肠球菌属有较好的鉴定准确率外, 葡萄球菌属和链球菌属的鉴定准确率均不理想, 分别仅为62.5%和33.3%, 酵母的鉴定准确率则更低, 仅11.1%。为得到更好的鉴定准确率, 更有效地协助临床诊断感染, 在本研究后期对前处理方法进行修改, 增加了SDS的洗涤过程。SDS是一种温和去污剂, 有相关文献报道SDS可用于血培养念珠菌阳性的处理, 可溶解血液中的血细胞, 通过离心和洗涤去除其他干扰因素, 纯化要鉴定的细菌, 增加鉴定的正确率。通过SDS洗涤, 葡萄球菌属的鉴定准确率增加至95.6%, 链球菌属的鉴定准确率增加至90.0%, 酵母的鉴定准确率也增加至50.0%, 其中在23株近平滑念珠菌中有18株得到正确鉴定。而革兰阴性杆菌的鉴定准确率略有降低, 可能和后期出现的15株沙门菌鉴定准确率较低有关。在复数菌的鉴定中, 经过SDS洗涤, 鉴定准确率也有大幅度增加, 9例中有6例正确鉴定出2种病原菌。当然本研究复数菌的例数较少, 混合菌种类型较少, 还需更多的数据来证明。
本研究结果表明, 在阳性血培养的直接鉴定中, 用分离胶促凝管法富集菌体后增加SDS的洗涤处理, 操作简单, 对增加MALDI-TOF MS的鉴定准确率有较大帮助, 值得在临床微生物实验室推广。
