定量PCR技术基本原理和方法以及PCR产物的检测与定量-2
1、非竞争内标定量PCR
从细胞类标本中提取靶基因（核酸）时，同时会提取大量与靶基因无关的DNA或RNA；可以把这些靶基因无关DNA或
RNA作为内标与靶基因同步扩增，即在同样的反应条件下，在一个反应试管内同步扩增来自同一标本的一段靶基因序列和另一段无关的内标序列，不享受同一引物和引物结合位点，内标序列扩增可校正诸如DNA含量、标本内PCR聚合酶抑制物，不同反应管间扩增效率的差异，通过比较两种序列和内标序列的扩增产物即可对靶基因相对定量该方法目前主要用于检测靶基因在体内的含量前后变化，用于疾病的治疗检测。这种方法应注意靶序列和内标序列的扩增效率差异和初始模板
DNA含量比例关系和循环次数所导致的“平台效应”对结果的影响。该法的主要优点是简便（不需构建内标品操作），可以消除反应管之间差异和一定程度上消除标本间变异。
2、竞争定量PCR（competitive quantitative PCR）
竞争定量PCR是先构建一个与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因和内标物和引物（primer）竞争性结合，进行同步扩增，由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少，但两种扩增产物的比值和两种初始状态时模板分子数的比值是一致的。根据标准品的准确含量制作标准曲线，从而进行准确核酸定量。由于内标品构建中特别要求是Ev与靶基因扩增效率一致，如果靶基因序列和内标相同，那么扩增过程中两者的实际扩增效率就接近一致，就可以对靶基因进行绝对定量，即确定样品中靶基因准确分子数，否则只能相对定量，即确定样本间靶基因分子数的差异，总体上说，加入内标物，消除
PCR扩增过程中于反应管和反应管间以及标本之间存在差异。因此，内标法是目前PCR定量方法中最准确的方法，但构建内标物是建立本方法的关键。
构建内标物的基本原则是内标物具有靶基因的相同扩增条件和相同扩增效率。和可区别于靶基因探针结合位点与不干扰靶基因的扩增。因此，理想的内标物应具备与靶基因序列待分析序列相同的引物结合位点，相似的或相同大小、相似的碱基排列顺序。目前，内标法构建的方法有：靶基因扩增产物的突变；限制性片段的插入或缺失；含靶基因引物结合位点的非同源性DNA序列等，其中通过PCR方法构建的探针结合位点核苷酸直接突变构建的内标物是目前应用最多、最方便的方法。
三、 PCR 产物的检测与定量
定量PCR检测靶基因核苷酸的含量最终是通过对其PCR产物的特异性检测和定量而推测算出来的，根据对PCR 产物检测方式不同分为终点法（Terminal detection）和实时检测法 (real time detection).
(一) 终点检测法(Terminal detection）
终点检测法就是PCR扩增反应结束后，对其产物进行分析和定量检测的一种方法，终点法检测要特别注意“平台效应”对实验结果的影响。为了实现对PCR终产物的定量检测，必须对PCR产物进行预先标志。目前标志物有：放射性同位素和非放射性标志物。放射性同位素因放射性因素而目前很少用，后者包括螺旋结构染料（如溴化乙锭等）、地高辛、生物素以及荧光素（包括普通荧光素如Fam、TRAMA和镧系螯合物等），地高辛、生物素以及荧光素可以通过标志dNTP或引物的5’端从而掺入PCR扩增产物中，除荧光素标志产物可直接发光外，其余可与HRP或
AKP标志的抗地高辛抗体或亲和素反应，加入底物后产生颜色、发光或荧光信号，从而进行检测。这些标志物进行标志的是检测时的捕获剂或是作为定量检测的指示剂；根据对PCR终产物的检测特异性不同又可分为：
1. 琼脂电泳扫描检测法：
PCR产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭进行染色然后进行扫描；预先用放射性标记的可进行放射自显影或特异性扩增琼脂片的放射性计数；预先荧光素标记核苷酸进行定量，DNA测序仪可克服琼脂电泳的序列非特异性检测问题，可用于内标和外标法检测，但是由于全自动DNA测序仪耗时及费用昂贵，目前仅限于实验室研究用。
2. 固相捕获法（solid phase capture）
固相捕获法多数是利用亲和素或抗地高辛抗体包被聚丙烯酰胺微孔板或磁性小珠，利用亲和素和生物素或地高辛和抗地高辛抗体系统对预先标记生物素或地高辛的产物进行捕获然后与特异性标记的探针进行杂交或非特异性检测。或是使生物素或地高辛化探针固相化，并与预先标记的PCR产物进行杂交，然后进行捕获信号显示，根据标记在探针或PCR产物终中的显示信号标志物的分分成不同的检测方法，如ELISA
检测又称PCR-ELISA，电化学检测，电化学发光检测法，荧光检测法以及时间分辨荧光检测法，是目前终点法检测应用最方便的方法。目前有三种设计模式
