血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳
原理
本实验利用聚烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳仅能分成5~7个组份，而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12~30个组份。
操作
(一)凝胶柱的制备：
1．取已准备好的10×0.6cm的玻管，从一端量至7cm处，用玻璃腊笔划线。起始端用胶布包封好后，插入橡皮塞中，垂直放好。
2．分离胶的制备：
(1)按分离胶配制表的比例(附后)，取1号、2号试剂和蒸馏水加入一小烧杯中，混合后，再加入3号和4号试剂，混匀后即成为分离胶溶液(此溶液约在半小时内聚合为聚丙烯酰胺凝胶，故应尽快操作。如室温较高时，为防止过快聚合，可放置冰浴中操作。或根据聚合速度的快慢，适当调整TEMED的加入量)。
(2)用5ml注射器、18号针头或用长细滴管吸取分离胶溶液，将其沿玻管管壁注入玻管，直至7cm划线平面。
(3)用长细滴管吸取蒸馏水，沿管壁在分离胶的液面上加注0.5cm高的水层。加水时必须缓慢细流，尽量减少胶液表面的震动与混合。(加注水层是为了使凝胶聚合后的表面平整而不致出现弯月形，并能使凝胶与空气隔绝。这一步很重要，它将直接影响分辨率与带形)。
(4)将加注好的凝胶管静置1小时，以进行聚合反应。在聚合过程中，起初凝胶与水层的界面逐渐消失，待胶体形成后，其界面又将重新可辨。这一现象可用来观察判断凝胶的聚合是否完成。
3．浓缩胶的制备
(1)按浓缩胶配制表的比例取2号、5号试剂和蒸馏水加入另一小烧杯中，混合后，再加入3号和4号试剂，混匀后即成为浓缩胶溶液。(在制备浓缩胶时，也常用核黄素催化的光聚合来代替过硫酸铵催化的化学聚合作用)。
(2)用滴管和滤纸小心地吸去已聚合好的分离胶胶面上的水液。注意切勿触及胶面。
(3)用长细滴管或注射器吸取浓缩胶溶液，在分离胶胶面上沿玻管壁小地注入0.5~1cm高的胶液。然后同样沿玻管壁缓慢细流地加入0.5cm高的蒸馏水。静置一小时后即可使用。
在加样之前先用滴管或滤纸小心地吸去浓缩胶胶面上的水液。
(二)加样：
用50μl的微量注射器，取12μl血清，加12μl的40%蔗糖溶液(1∶1稀释)，再加入40μl0.05%溴酚兰指示剂，混匀。每管中加入该混合液16μl，共可加4管。每管实际加入纯血清3μl，含蛋白质196μg。(血清蛋白质含量为6.2克/100毫升血清)
若需增减管数，亦照此加样比例推算。
(三)电泳
(1)将加样完毕的凝胶管上端垂直插入上电极槽底板的橡胶塞孔中。并去掉下端的橡皮塞和胶布。
(2)先用长细滴管吸取电极缓冲液，在已插好的凝胶管样品液面上，小心地逐管加满电极缓冲液。然后将电极缓冲液慢慢地倒入上、下电极槽中。注意避免和排除凝胶管的上、下管口内留有气泡，否则会影响导电。电极缓冲液的加入量，上槽以电极能完全浸入为宜，下槽以凝胶管浸入3/5为宜。
(3)将上槽的电极接电泳仪的负极，下槽的电极接电泳仪的正极。先调节电流为1mA/管，待示踪染料进入分离胶后，再调节电流为2~3mA/管。待示踪染料迁移至距管下口0.5cm时，切断电源，电泳完毕。
(四)剥胶
取下凝胶管，用带10cm长针头的注射器吸取蒸馏水作润滑针。将针头小心插入管壁与胶柱之间，一边注水，一边使针头紧贴管壁慢慢呈螺旋式前进。如果一头不行，再在另一头按同样的方法剥离，直至胶柱与管壁分开，从玻管中滑出。如胶柱不能滑出，可用洗耳球从一端加压吹出。
(五)固定、染色及漂洗：
将剥出的胶柱浸入8号试剂60℃水浴30-60分钟，进行染色，然后用清水冲洗掉多余的染料。
试剂
| 试剂号 | 名称 | 配制方法 | pH |
| 1 | 分离胶缓冲 |
1N HCl 48.0ml Tris 36.3g 加蒸馏水到100ml |
8.9 |
| 2 | 单体交胶剂 |
丙烯酰胺30.0g 甲叉双丙烯酰胺0.8g 加蒸馏水到100ml |
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| 3 | 催化剂 |
10%过硫酸铵(临用前配制)100mg/ml |
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| 4 | 加速剂 |
四甲基乙二胺(TEMED)1ml加蒸馏水 稀释到10ml |
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| 5 | 浓缩胶缓冲液 |
1N HCl 48.0ml Tris 5.98g加蒸馏水到100ml |
6.7 |
| 6 | 电极缓冲液 |
甘氨酸28.8gTris 6.0g加蒸馏水至100ml临用前按1∶10比例稀释 |
8.3 |
| 7 | 示踪染料溶液 |
溴酚兰0.05g加蒸馏水溶解至100ml |
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| 8 | 固定染色液 |
考马斯亮兰G25010mg 无水乙醇4.7ml 磷酸8.5ml 定容到100 ml |
凝胶溶液配制表
| 试 剂 | 分 离 胶 溶 液(ml) | 浓 缩 胶 溶 液(ml) |
| 1号 | 1.25 | —— |
| 2号 | 2.5 | 1 |
| 5号 | —— | 1.25 |
| 蒸馏水 | 6.05 | 7.35 |
| 3号 | 0.05 | 0.1 |
| 4号 | 0.15(1∶10稀释液) | 0.3(1∶10稀释液) |
| 总体积（ml） | 10 | 10 |
| 浓度（g%） | 7.7 | 3.0 |
附注：凝胶聚合速度受温度影响较大，温度低时，聚合速度减慢，需适当调整3号及4号试剂的用量，达到在30分钟左右聚合。
器材
1．园盘电泳槽 2．电泳仪3．玻管(10×0.6cm)
4．50μl微量注射器、5ml注射器
5．10cm长的局麻针头、18号针头
6．长细滴管 7．小浇杯8．橡皮管、吸耳球等
注意事项：
1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯胺是神经性毒剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。
2．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内(4℃)保存。可贮存1~2月。测定pH值(4.9~5.2)可检查其是否失效。失效液不能聚合。
3．TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。
4．凝胶的聚合速度与温度关系很大，必须根据实验时的温度调整3号、4号试剂的用量，以使凝胶在30分钟内聚合。
