药品微生物限度检验误差分析
通过对造成检验误差原因的分析，消除或尽可能降低在实验过程中可能发生的误差和错误结果，提高检验的准确性。
药品是特殊的商品，必须保证其质量，用药的安全与有效。应用微生物学技术方法监控药品的有效性及安全性是药品微生物学检验质量保证的基本任务。生物检验法是目前微生物检测的首选法，但此法操作程序多，步骤繁杂，任何疏漏或非标准化的操作条件，均可导致测定结果的误差。为了使检验结果反映药品的污染状况，在具体检验操作中还需要有一系列的技术措施保证，以便客观地反映污染程度，提高检验结果的准确性，消除或尽可能降低实验过程中可能发生的误差和错误结果。下面就造成检验误差的原因及控制方法分述如下：
1.培养基的影响
培养基是培养检测细菌的营养制品，其质量的好坏、稳定与否，对检验结果有极为重要的影响。多数厂家生产的干燥培养基一般质量较稳定，须按使用说明条件配制和存放，在规定的效期内使用，对初购的培养基应进行质量检查。对自配培养基应测定其有效性及灵敏度。在更换配方成分时应进行质量检查。
1.1 已知茵对照试验
各种专一和特殊用途的培养基，特别是生化鉴别试验培养基，在初次使用前，均须用已知的菌株作对照，测定各种生化及其它反应的质量效果，以保证培养基各种鉴别反应的灵敏度和准确性。
1.2酸碱度测定
各种细菌皆有其适宜生长繁殖的pH值范围，而且有些细菌要求较严，因此培养基的pH极为重要。配制过程中测试pH时，必须以冷却后的温度为准，否则颜色反应不准；各种培养基所要求的最终pH，是制成品灭菌冷却后的实际pH。因冷热的温差较大，其pH各异。另外，调节pH时应逐渐加碱，防止过量，否则如再加盐酸矫正，必将会增加培养基内的含盐量，可降低培养基的使用效果，影响细菌生长。用氢氧化钠调节的弱碱性培养基，高压灭菌前pH可比最终pH约高0．2左右，灭菌后基本合适。如用碳酸氢钠调节pH的培养基，灭菌前的酸碱度应稍低于最终要求的pH值，一般灭菌后稍增高或不变。
1.3培养基的制备
制备后的培养基应及时灭菌，不应放置，避免细菌繁殖。要取均匀的供试液注皿，如取上清液或沉淀物对试验结果必然有影响。注皿时培养基应在(45±1)℃，高于45℃时易造成细菌受损或致死，低于45℃时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。从供试品稀释、注平皿、倾注培养基，全部操作应在1 h内完成，避免由于时间过长，导致细菌细胞繁殖或死亡。培养基平皿要及时与皿内供试液振摇均匀，防止细菌重叠生长或成片，影响计数。
2.设备的影响
对各种器械及设备均应有定期检定与维修记录，以保证其正常使用。各种培养箱除定期计量认证外，于培养箱内置放最高、最低温度计，每天观察温度波动范围。玻璃仪器、容量仪器须校验，玻璃器械均应洗涤干净，不残留酸碱及抑菌物质。
3.计数误差
3.1
在进行菌落计数时，应仔细观察。菌落生长小而密集，最易发生计数误差，要仔细判断。勿漏计细小的、琼脂内和平皿边缘生长的菌落，同时应注意细菌菌落与供试品中颗粒、沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间5～7 d，细菌菌落常会生长增大而容易鉴别。
3.2
供试品稀释液中常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后也可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落相鉴别的有形物，为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的稀释液多增加注皿1～2个，注皿后不经培养而放置于冰箱(勿冻结)中，在计数菌落时作为对照。或用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。
（小编注：根据15版中国药典，营养琼脂已不使用；TTC已不使用）
3.3
供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可计在菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。例如，乳酸菌素制剂中含量测定与细菌总数测定分别采用不同方法加以区别。
3.4
菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在24 h，霉菌点计需在48 h作初步点计(点计霉菌菌落时，动作宜轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形成的孢子散落在平板的其它部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差。
3.5
由于培养中一些菌落蔓延生长而影响另一些菌落生长，甚至掩盖了一些菌落，干扰计数。防止菌落蔓延方法如下：
(1)加0.001％1Tc营养琼脂在倾注培养基前，在每1000 ml营养琼脂内加入灭菌1％TIC溶液1 ml(最终浓度为0.001％，混匀后倾注平皿)。
(2)开盖干燥将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机1～2 h后合盖，再放培养箱中。
(3)换陶瓦盖将已凝固的琼脂平板盖换上新近经干热灭菌后的陶瓦盖。
3.6
当高稀释级平均菌落数大于或等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定。
4.无菌室方面造成的误差
无菌室的微生物评估是对环境监控不可缺少的指标，它涉及到洁净状况，灭菌消毒状况等的有效性，并能有效检验操作者对控制环境中微生物状况足够造成影响的操作行为。
4.1 定期检查无菌室的空气是否符合规定
无菌室常用臭氧消毒器产生的臭氧气体，对空气进行有效消毒，杀菌效果不受物体遮挡影响，消毒无死角。臭氧在常温下自行逐渐分解为氧，半衰期为20一30 min，分解过程中产生十分活泼具有强烈氧化作用的单氧原子、氧化离子团，能在瞬间杀灭细菌、病毒、霉菌等微生物，是公认的快速、高效、广谱、安全的杀菌剂。为了确保环境的无菌状况，操作前应对操作环境的无菌状况进行监测，最常用的方法为菌落计算法：将经过预培养的普通琼脂培养基的无菌平皿3个，分别放置工作面的左、中、右处，开盖，暴露30 min后，置30～35℃培养48 h，平皿内的平均菌落数少于1个。如超过，应立即停止使用，需彻底消毒灭菌。
4.2严格无菌操作
正确而熟练地掌握无菌技术是准确完成检验工序，得到可靠结论的前提。无菌室内仅存放最必须的检验用具，保持固定位置，不随便移交。在洁净室中最关键的污染源是人员，污染率取决于无菌操作区操作者的操作活动。操作时应在近火焰区操作，而且在所有操作中均不应大幅度或快速动
作，以免搅动空气中尘埃微粒。
5.被测药物性质的影响
5.1供试液的制备
按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。制备供试液时，力求均匀分散。因为测定中一个细菌可能繁殖成一个菌落，而一群也可能只形成一个菌落，测定时与匀质方式、条件关系极为密切，分散充分时，菌落生长数多，反之菌落数就少。
5.2供试品的抑菌性
很多药物有抑菌或杀菌的作用。检验结果的准确性，主要取决于供试品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖。有抑菌作用的检验结果是不准确的，应排除其抗菌作用。对含抑菌成分的供试品来说，供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌，不能检出时，该供试液须按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。常用的方法有：稀释法、中和法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法。
（小编注：2015版中国药典已删除离心沉淀集菌法）
6.抽样
抽验部分样品推断整批药品的微生物质量，是药品微生物限度检验的基本任务。药品微生物检验不同于化学药品的含量测定，因为污染于药品中的微生物具有特殊性：
第一，药典中以活的微生物作为检验对象。
第二，分布的不均匀性。在一个批号内产品有的被污染，有的不兹污桨，分方万匀；在被污染的部分中，有的数量极多，有的较少，种类上可以复杂或较单一。
这种不均匀性源于污染原的复杂性，有原辅料污染、工艺污染、空间污染和操作人员污染等等构成污染量的多少差异，形成不均态。再者，微生物具有族团性，族团大小、紧密程度是可遗传的，族团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。正因为以上这些特点，抽样方法、抽样数量、抽样次数等抽样状况很大程度上决定着检验的结果。遵循随机原则的概率抽样可以保证抽选出代表性较高的样本，使样品具有代表性，保证样本推论总体的可靠性。
