特定细胞类型标记的细胞核分离
从大量的植物或动物组织中分离出特异性的细胞类型是费力和棘手的。为了研究表观遗传学上的改变和在不同细胞系中不同表达的基因，如癌细胞与正常细胞，或者拟南芥中两种类型的表皮细胞(epidermal cell)，人们通常必须采用激光捕获显微切割(laser capture microdissection, LCM)或者荧光激活细胞分类(fluorescence-activated cell sorting, FACS)方法。LCM使用激光和显微镜来直接从组织中轻快地挑出单个细胞到容器里。这就像是在玩挑圆片游戏一样，但是每次实验需要挑出上千个单独细胞，因而这是件非常烦恼的事。与FCAS一样，LCM也需要昂贵的设备。
来自Fred Hutchinson癌症研究中心的Roger Deal和Steven Henikoff已经开发了一种便宜且又简单的方法，即特定细胞类型标记的细胞核分离(isolation of nuclei tagged in specific cell types, INTACT)。该方法基于标准的基因技术，并采用已知的生物学中最强的非共价结合反应---一种复合维生素B，生物素(biotin)，结合到细菌蛋白链霉亲和素(streptavidin)。这种分离方法不需要特殊的培训，仅使用常用的实验室设备---数个移液管、一个磁体以及链霉亲和素包被的磁珠。Deal现在正计划使用这种技术研究多种植物组织中的细胞分化。
INTACT该方法具体流程如下(见下图)：
①研究人员插入表达一种融合蛋白NTF的基因，该融合蛋白包括一种结合到细胞核被膜上的蛋白，用于可视性观察的绿色荧光蛋白GFP，和一种结合到生物素上的蛋白BLRP。他们还加入一种表达连接酶BirA的基因，该连接酶催化生物素结合到BLRP上。
②NTF还要附加在细胞类型特异性的启动子后面，这样当植物幼苗(seedling)生长时，插入的基因只在期望的细胞类型中表达---这里为根毛细胞。BirA在所有细胞中表达，但只催化生物素结合到带有NTF标记的细胞核表面上的BLRP。
③将植物组织全部捣碎；将所有的细胞核提取出来，并与链霉亲和素包被的磁珠混合在一起，其中链霉亲和素包被的磁珠将牢牢地结合生物素。再将细胞核-磁珠悬浮液灌注入一根简单的柱子(1ml移液管尖端的轴)。磁珠将会通过环绕在移液管尖端的磁体的磁性作用而保留下来。
④只有细胞核是来自植物组织中表达NTF的细胞类型时，它们因而才会被生物素标记，将结合到链霉亲和素包被的磁珠上。来自其他细胞类型的细胞核将会被直接冲洗走，这样就能够捕获特定细胞类型纯化的遗传物质。
参考文献：
Roger B. Deal et al., "A Simple Method for Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types within a Tissue",Developmental Cell, Volume 18, Issue 6, 1030-1040, 15 June 2010, DOI:10.1016/j.devcel.2010.05.013.
情况一览表 | ||||
细胞分类方法比较 | 设备成本 | 实验时间 | 准备时间 | 细胞产量 |
激光捕获显微切割 | >20万美元 | 3天 | 1-5 天(以便准备样品) | 10–1000 |
直线加速器相干光源(Linac Coherent Light Source) | >40万美元 | 1-3小时 | 1-5 天(以便准备样品) | >10万 |
特定细胞类型标记的细胞核分离 | 500美元 | 1小时 | 2个月(以便让转基因植物生长) | >10万 |
