聚合酶链式反应(PCR)技术
原理
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction
PCR)是一种体外扩增特异性DNA片段的技术。它可以在体外特异地对目的基因进行大量扩增，其巧妙之处在预先设计合成二段分别与待测目的基因二端互补的引物，以起到指向定点的作用；再借助于DNA聚合酶催化的若干次扩增反应后，即可使特定的基因片段成百万倍的扩增。扩增反应分三步：
①变性：当通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。
②褪火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。
③延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物，以及Mg2+存在的条件下，
以引物为起始点，从5′→3′催化的DNA链延伸反应。
以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一循环的模板，若干次循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段就得到了大量的复制，数量可达2×107～8拷贝，PCR的实验操作包括模板DNA(或RNA)的制备、引物的设计合成、酶促聚合反应、反应产物的检测等。
操作步骤
(一)模板DNA(靶序列)的制备
进行PCR扩增反应的模板可以是人体组织细胞的染色体DNA，微生物的DNA，或是由mRNA反转录而成的cDNA等。本实验用小鼠肝脏制备染色体DNA作为PCR扩增的模板。
1. 取肝组织0.5g加入2ml裂解液。
2. 冰浴匀浆。
3. 取匀浆液200μl加入裂解液200μl。
4. 加入蛋白酶k至终末浓度为100μg/ml。
5. 以上溶液在65℃保温数小时或过夜，不时震摇。
6. 加入75μl 8M KAC，混匀。
7. 在4℃放置15分钟。
8. 加入750μl氯仿。
9. 经充分震摇后5 000rpm、离心5分钟，将上清液转入一新的Eppenderf管，沉淀弃去。
10. 加入750μl无水乙醇，充分混匀，-20℃静置30分钟。
11. 12 000rpm、离心10分钟，弃去上清，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm、再离心5分钟，弃去上清，于室温将有DNA沉淀的Eppendorf管敞开15～30分钟，使痕量乙醇挥发。
12. 将DNA沉淀团块溶于100μl TE缓冲液，加RNA酶1μl，在37℃水浴放置30分钟。
13. 用等体积的酚/氯仿抽提一次。
14. 取上清，加入1/10体积的NaAc(pH4.8)和2倍体积的无水乙醇，混匀。
15. 12 000rpm、离心10分钟，弃去上清，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm，再离心5分钟，弃去上清，于室温将有DNA沉淀的Eppendorf管敞开15～30分钟，使痕量乙醇挥发。溶于50μl TE。
16. 取1μl样品用500μl双蒸水稀释，在260nm和280nm处测定吸光度。鉴定样品纯度并计算其含量。
17. 将DNA溶液保存于-20℃备用。
二)PCR反应
1. 按以下次序将各组分在0.5ml灭菌管内混合
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灭菌水 |
30ul |
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10×扩增缓冲液 |
10ul |
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4种dNTP混合物，每种浓度1.25mmol/L |
16ul |
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引物1(溶于5ul水) |
100pmol |
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引物2(溶于5ul水) |
100pmol |
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模板DNA(可至2ug，取决于靶序列含量) |
加水至总体积100/ul
2. 于94℃加热反应混合液5min，使DNA完全变性。
3. 将0.5ul Taq DNA聚合酶(5单位/ul)加入经变性处理后的反应混合中。
4. 用100ul矿物油覆盖于反应液上，这样可防止样品在反复加热、冷却的过程中蒸发。
5. 典型的变性、褪火和延伸条件如下：
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循环 |
变性 |
退火 |
延伸 |
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首轮循环 |
94℃ 5min |
50℃ 2min |
72℃ 3min |
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中间循环 |
94℃ 1min |
50℃ 2min |
72℃ 3min |
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末轮循环 |
94℃ 1min |
50℃ 2min |
72℃ 10min |
中间循环一般进行25～30次。PCR扩增反应一般在自动 PCR仪上进行，需要注意的是对文件的设置和连接不能有错。
6. PCR末轮循环后不再变性，样品转至-20℃保存。
注：PCR反应中各步反应的条件，可根据具体情况酌定。
(三)PCR产物的凝胶电泳分析
PCR反应后，可以通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR所产生的片段大小，以及有无预期的特定片段长度的DNA扩增产物的生成，从而分析PCR的效果及特异性，或者是判定有无特异地扩增反应进行，以达到基因分析的目的。电泳分析操作参见实验十二。
仪器与器材
1. 台式高速离心机2. PCR扩增仪
3. 电泳仪、电泳槽4. 可调式微量加样器及吸头
试剂
(一)制备模板DNA用试剂
1. 裂解液：终浓度0.5%、SDS、0.1mol/L NaCl、0.05mol/L Tris HCl pH8.0、1mmol/L
EDTA、100μg/ml 蛋白酶K(临用前加入)
2. 8M KAc3. 氯仿4. 无水乙醇5. 70%乙醇
6. TE缓冲液：终浓度为10mmol/L Tris HCl、1mmol/L EDTA
［配制1mol/L Tris-HCl(pH7.4)和0.5mol/L EDTA(pH 8.0)的储存母液，临用前混合稀释］
7. RNA酶：10mg/ml8. 3mol/L NaAc(pH4.8)9. 蛋白酶K：20mg/ml
(二)PCR反应用试剂
1. 引物：
引物的合成一般选择具有种属特异性的某一段序列，这样就可以保证PCR扩增的特异性以及扩增的效率。一般引物至少应含16个核苷酸，可长达20～24个核苷酸。引物在PCR中浓度通常是1μmol/L，这一浓度足以完成30个循环的扩增反应。引物浓度过高，将导致非特异性扩增；而引物浓度过低则PCR的效率极低。
2. dNTPs： dNTPs系在饱和浓度下使用。用之前，应用1mol/L NaOH将其储液PH调到7.0，保证终反应PH不低于7.1。
3. 用于PCR的缓冲液10×扩增缓冲液： 终浓度为500mmol/L KCl、100mmol/L Tris·HCl(PH8.3 室温)、15mmol/L MgCl2、0.1%明胶。
4. Taq DNA聚合酶： 一般PCR所需酶量约为2单位，加酶量过多导致非靶序列扩增。
