双脱氧链终止法测定DNA序列实验原理、操作步骤和仪器...-3
3．单链模板的分离
(1)沉淀M13：在上述M13培养物上清中，加入0.2倍体积的3.5mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液，颠倒混匀数次，置冰浴30分钟。离心15-30分钟(11000g)可见白色噬菌体沉淀。小心除去上清液，可将试管倒置并吸去多余液体。
(2)分离纯化模板：向沉淀中加入TE缓冲液100μl，轻轻混匀使沉淀重悬，(以下步骤可在微量离心管中进行)。再加等体积酚/氯仿试剂，旋转振荡30秒，离心1分钟使分层。小心将上层液转移至另—干净离心管中。用酚/氯仿重复抽提一次并转移上层液。
加等体积氯仿，离心，转移上层液至洁净管中，并重复1次。
加1/10体积3mol/L醋酸钠(pH7.5)及两倍体积100%乙醇，混合，置干冰(或-40℃冰箱)中15分钟，离心10分钟，除去上清，加冰冷的70%乙醇lml，离心，除去上清，于真空条件短暂干燥。
加入20μlTris缓冲液溶解DNA沉淀，储于-20℃待用。
用于测序的DNA，其A260/A280光密度比值至少应大于1.7。
[试剂与器材]
1．试剂
(1)退火缓冲液：1mol/L Tri-HCl(pH7.6)，l00mmol/L MgCl2和160mmol/L DTT。
(2)通用测序引物：5’-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3’，在水溶液中(5pmol/μl)。
(3)T7DNA聚合酶(8ug/μl)：在加有甘油的缓冲液中,应储于-20℃，用时吸取1份后迅速放回。稀释液可在4℃保存l周。
(4)酶稀释缓冲液：20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L DTT，100 u g牛血清白蛋白/m1，5%甘油。
(5)标记用混合物(Labelling Mix)：dCTP，dGTP和dTTP各1.375μm，333.5mmol/L NaCl。
(6)模板：l0μg单链M13mpl8DNA在50μ1Tris-EDTA缓冲液中。
(7)“A”mixshort：dCTP，dGTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/L dATP，14μmol/L ddATP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/L NaCl
(8)“G"mixshort；dATP，dCTP和dTTP各840μmol/L，93.5μmol/LdGTP，14μmol/L ddGTP，40mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl
(9)"C"mixshort：dATP，dGTP和dTTP各840μM，93.5μmol/LdCTP，14μmol/L ddCTP，40mmol/L Tris- HCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。
(10)"T/mixshort：dATP，dCTP和dGTP各840μmol/L，93.5μmol/L dTTP，14μmol/L ddTTP，40mmol/L TrisHCl(pH7.6)，50mmol/LNaCl。
(11)终止液：溴酚蓝和二甲苯腈蓝FF各3%，l0mmol/L EDTA(pH7.5)，97.5%去离子甲酰胺。
(12)标记脱氧核苷酸：[α-32P]dATP，10mci/m1，3000ci/mmol。
说明：除试剂12购自Amersham公司外，其余上述试剂均包括在Pharmacia Biotech公司的T7SequencingTMKit试剂盒内。
(13)显影剂
(14)定影剂
2．器材
恒温加热器或恒温水浴槽；涡旋振荡器；台式高速离心机；恒功率电泳仪；测序用电泳槽(附玻板及隔离条)盖革计数器；可调式加样器；微量离心管
(Eppendorf管)；胶带；剪刀；手术刀；烧杯(100ml)；梨形瓶(100ml)；水泵；注射器(50ml)；注射器针头(18号)；新华滤纸
(3号)或Whatman滤纸(1号)；保鲜膜；凝胶干燥器材；抽气泵；增感屏；X光胶片；显影及定影用具。
