DNA序列测定技术（Sanger双脱氧链终止法与Maxam－Gilbert...-2
二、Maxam－Gilbert DNA 化学降解法
与包括合成反应的链终止技术不同，Maxam-Gilbert法要对原DNA
进行化学降解。这一方法是在体外研究lac阻抑制与lac操纵基因相互作用时酝酿发展起来的。时至今日，可以探测DNA 构象的蛋白质－DNA
相到作用，仍然是Maxam- Gilbert法独具的鲜明特点。在这一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一个末端标记的DNA
片段在5组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某于种或某一类碱基。因此生成5组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA
分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA
全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。相对而言，Maxam-Gilbert法自初次提出以来，基本没有变化。虽然设计了另一些化学降解反应（见综述：Ambrose和Pless，1987），但这些反应一般只作为Maxam和
Gilbert(1977，1980)最早提出的反应的补充。这一方法的成败，完全取决于上述这些佞两步进行的降解反应的特异性。第一步先对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰，而第二步修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5'和3'的磷酸二酯链断裂。在每种情况下，这些反应都要在精心控制的条件下进行，以确保每一个DNA
分子平均只有一个靶碱基被修饰。随后用哌啶裂解修饰碱基的5'和3'位置，得到一组长度从一到数百个核苷酸不等的末端标记分子。比较G、A＋G、C＋T、
C和A>C各个泳道， 右从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA 序列。由于种种原因（如采用32P进行放射性标记、末端标记DNA
的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能测定的长充要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端
250个核苷酸以内的DNA
序列效果最佳。在70年代Maxam-Gilbert法和Sanger法刚刚问世时，利用化学降解进行测序不但重现性更高，而且也容易为普通研究人员所掌握。Sanger
法南非要单链模板和特异寡核苷酸的，并需获得大肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow
片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需要人所共的简单化学试剂。但随着M13
噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA
分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA
修饰的情况，不可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA 二级结构及蛋白质与DNA
的相互作用。然而，由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。
类核苷酸类惟物的耐受性看来也优于原来的测序酶。
三、测序策略
确证性测序
从头测序
开始测序之前，必须根据待测序列区的长度，所要求的测序精确度以现有有设施来制定测序总策略。只有一小部分的研究划需需分从头测定大段从测定过和序列，而列多的情况是通过测序对突变（如点突变和缺失）进行定位和鉴定，并证实构建的重组DNA
的方向与结构。用于上述两种目的的方略大不相同。
（一）确证性测序
确证性测序（例如对利用寡核苷酸倡导的诱变而产生的突变体进行测序）往往只需要仅仅一套反应，以取得双链DNA
其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只须对亚克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序，即可如原以偿。在许多情况下，等测区落于通用引物的测序范围之内；若不然，最好的方法就是合成一段长度为17-19核苷酸的寡核苷酸引物，与距离待测区约50-100核苷酸的序列互补。只要可能，应同时测定野生型基因上同源区的序列和突变的相应序列。直接在同一张放射自显影片上对照有关序列，极有助于确证变异区序列并将使突变体与野生型基因之间任何出乎意料之外的其他差异一目了然。
（二）从头测序
从头测序的目的是要提供一段DNA 的准确核苷酸序列，这一区段可长达数千碱基，而其序列从来未经测定。由于单套测序反应所能准确测定的靶DNA
序列最长可达400碱基左右，因引进行从头侧序必须经过精心策划。长约400碱基的枝DNA
可以按互为相反的方向分别克隆于2种M13噬菌体载体（如M13mp18 和13mp
119）上。然后每条链的全序列可以通过利用通用测序引物进行的单套反应得以测定。如果要对更长的靶DNA
（如长达数千碱基）进行测序，则可在两种通用策略中一而行：
（1）随机法（或鸟枪测序法） 在随机法中，序列资料是从含有靶DNA 随机片段的亚克隆中收集而来的。既不须努力确定这些亚克隆在靶DNA
中的位置，也不必设法查明究竟测出的是哪一条链的序列，只要把积累资料贮存起来，最后可用计算机排列妥当（Staden，1986）。这一方法是由剑桥的医学研究委员会（M．R．C．）实验室率推行的，曾经成功地用于测定人线粒体DNA
（Anderson 等，1981）、人腺病毒DNA （Gingeras等，1982;Roberts等，1986）、λ噬菌体DNA
（Sanger等，1982），以及Epstenin-Barr病毒DNA （Baer等， 1984）的序列。
（2）定向法 在定向法中，靶DNA 的测序按计划有秩序地进行。例如，靶DNA
的全序列可以通过测定一系列嵌套的缺失突变体的序列而获得，这些突变体具有相同的起点（通常在靶DNA
的一端）并分别穿入靶序列区纵深不同距离处，因此它们可以使靶DNA
中更遥不可及的区段渐进地落入可利用通用引物进行测序的范围之中。另一种方法是，利用一套反应中取得的核苷酸序列设计新的寡核苷酸充当后续一套反应的引物，从而循序渐进地获得从示测定过的靶DNA
片段的序列。因此在这一方法中。DNA 序列的积累是通过沿DNA
链渐进移动引物结合位点而实现的。尽管对随机法与定向法的取舍通常由实验室的物力与专长所决定，但仍有一少其他因素也会影响最终的抉择，这些将在稍后加以讨论
