DNA序列测定技术（Sanger双脱氧链终止法与Maxam－Gilbert...-3
３．DNA 聚合酶
通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA
聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反转录酶（见文献，如Mieredorf和Prfeffer，1987）经过修饰消除了
3'→5'外节酶活性的T7噬菌体DNA
聚合酶（Sequenase）和测序酶2.0），Tabor和Richardson，1978]惟及从嗜热水生菌（T'hermus
aquaticus）分离的耐热DNA 聚合物（Taq DNA 聚合酶）。这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的DNA
序列的数量的质量。
（1）大肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段 这种酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然广泛用于DNA 序列测定的酶。
通常碰到的两个问题是：1）Koenow片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于dd
NTP的掺入，而是因为聚合酸人模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。由于该酶不能沿模板进行长中距离移动，因此利用该酶进行的标准测序反应所得序列的长度有限。通常，这一反应只能得到大约250-350个核苷酸的序列。
如果分两步进行反应，所得序列的数目可以翻一番；其中第一步是初始标记步骤，采用低浓度的dNTP，而随后的第二步是链延伸－链终止反应，含有ddNTP
和高浓度的dNTP（Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。然而即使有了这些改进，用
Klenow
酶所测序列的长度通常还是不如持续合成能力较强的测序酶。2）这种酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。将聚合反应的温度提高到55℃，可以缓解但并不能彻底解决这一问题（Gomer和Firtel，1985)。有时可采用一些dNTP类似物[如dITP或7－脱氮
dGTP（7－deaza-dGTP）]来获取模板中可形成稳定二级结构的相应区段的序列信息，但Kleow酶对这些类似物的作用不如测序酶有效，这也许是因为它们使Klenow酶原已较低的持续合成能力进一步降低。总而言这，可以选用大肠杆菌DNA
聚合酶IKlenow片段测定从引物5'位置起250个碱基以内的一段DNA 序列， 但不宜用它来测定更长一段DNA
序列或者具有二重对称和（或）同聚核苷酸段的DNA 序列。
（2）反转录酶 尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶解决一些由于模板DNA
中存在A/T或G/C同聚核苷酸区而引起的问题。来自禽类和鼠类反转录病毒的反转录酶在这一看来要比Klenow酶略胜一筹（Karanthaansis，1982;Graham等,1986
）,尽管它们也许还是比测序酶逊色（Cameron-Mills，1988;Revak等1988）。
（3）测序酶: 测序酶（SequenaseTM）是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA
聚合酶。这酶原来具有很强的3'→5'外切核酸活性，经过修饰后， 这一活性大部分均被消除。测序酶2.0版是测序酶的基因工程产品，它完全缺失了3'
→5'外切核酸酶活性，极其稳定而经活性要比经化学修饰的测序酶高2倍。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如dITP和7－脱氮－dGTP等用于提高分子辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸类似物具有广泛的耐受性。它是测定长段DNA
序列的首选酶。测序酶可以沿模板移动很长的距离，因而一套反应常常就可以测定数百个核苷酸的DNA
序列。实际上，测得序列的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。为了充分利用测序酶极高的持续合成能力，可采用两步测序反应。第一步首先采用低浓度的dNTP的较低温度，
以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP和较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP的有效掺入，这步反应的产物是仅仅延伸了20-30碱基的引物。
再将第一步反应等分于4组1套的标准反应系统中，每组反应中都含有高浓度的d
NTP和一种ddNTP。这样聚合反应就得以继续，直至造成链终止的核革酸掺入正在增长的链中。
（4）Taq DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶适用于测定在37 ℃形成大段稳定十级结构的单链DNA 模板序列。这是因为Taq DNA
聚合酶在70-75℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。按照1nnis 等（1988）介绍的方法使用Taq DNA
聚合酶进行测序，在放射自显影片上得到的测序梯连续数百个碱基条带始终清晰如一，表明这种酶的持续合成能力甚佳。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。
４．放射性标记的dNTP
直至几年以前，实际上所有DNA
测序反应都用[α－32P]dNTP来进行。然而32P发射的强β粒子造成两个问题。首先由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上的DNA
条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列（尤其是从放射自显影片的上部所读取的序列）的正确性并将制约从单一凝胶上能读出的核苷酸序列的长度。其次
32P的衰变会引起样品中DNA 的辐射分解，因此用32P进行标记的测序反应只能保存一两天，否则DNA
将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。[35S]dATP的引入（Biggin等，1983）大大缓解了上述两方面的矛盾。由于35S衰变产生较弱的β粒子，其散射有所减弱，凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反应中确切测定数百核苷酸的DNA
序列。此外，35S的低能辐射所引起的样品分解比较轻微，因此，测序反应可在－20℃保存至1周，而分辨率不见下降。这样，职果聚丙烯酰胺凝胶方面了发生技术故障，只要对测序反应进行重分析即可。
５．dNTP类似物
二重对称的DNA 区段（特别是GC含量高者）可以形成链内二级过程中不能充分变性。因此将引起不规则迁移，使邻近的DNA
条带压缩在一起，以致难以读出序列。这种压缩现象归因于DNA 二级结构的存在，而且不可能通过改变测序反应中出序列。这种压缩现象归因于DNA
二级结构地存在，而且不可能通过改变测序反应中所用DNA
聚合酶的种类而得到减轻。但是凝胶中的压缩区段往往可以通过采用诸如dITP（2'－脱氧次黄苷15'
－三磷酸）或7－脱氮－dGTP（7－脱氮－2'－脱氧鸟苷－5'
－三磷酸）等核苷酸类似物进行分辨。这些类似物与普通碱基的配对能力较弱，而且是测序酶和Taq DNA 聚合酶等DNA
聚合酶的合适底物（Gough和Murray，1983;Mixusawa等，1986;Innis等，1988）。但对某些压缩条带，7－脱氮－dGTP无济于事；同样，dITP也无补于另一压缩条带（尤其是得于GC丰富区的缩条带）的分辨。如果需要采用类似物，首先可试用dOTP，如果压缩条带用d
ITP或7－脱氮－dGTP都无法分辨， 则转而测定另一条链的DNA 序列几乎总能如愿以偿。如上所述，两种形式的测序酶和Taq DNA
聚合酶对核苷酸类似物的耐受性优于大肠杆菌DNA
聚合酶IKlenow片段。此外，制造厂商声称在测定含稳固二结构的模板序列时，测序酶2.0版要优于原来的测序酶。测序酶2.0版持续合成能力强于测序酶，其作用总是一气呵成，很少半途而废，因而消除了“鬼”带。
而且，测序酶2.0版对诸如dITP类核苷酸类惟物的耐受性看来也优于原来的测序酶。
