利用特异性多克隆抗体对磺胺类药物的免疫...
实验概要
磺胺类药物是一类重要的具有广谱抗菌作用的药物，主要用于预防和治疗细菌感染性疾病，也常做为饲料添加剂促进动物生长，但不合理的使用造成在动物性食品中残留，可能对人类的健康造成潜在危害。本试验利用ELISA检测磺胺类药物，有一定的实用价值。
实验步骤
1. 蛋白螯合
根据UV吸光值测量半抗原/蛋白的摩尔比率评价半抗原螯合蛋白(BSA，OVA)。半抗原/蛋白的摩尔比率基本一致，磺胺类药物/蛋白质的摩尔比率范围为20至40；而免疫原和螯合物的比率为3至9；对HRP螯合半抗原/HRPd摩尔比率范围为2至3。
2. 免疫
免疫原(0.20mg/0.5mLPBS)溶解于0.5mL弗氏完全佐剂中，肌肉注射于雌新西兰白兔(I和II)。间隔21天注射相同剂量的免疫原，每次免疫后10天兔耳静脉采血，当观察到效价不再增强时，收集全血凝聚后4℃保存，分离血清。获得八种血清(S3-I，S3-II，S4-I，S4-II，S6-I和S6-II)，所有血样4℃保存于50%饱和硫酸铵。
3. 血清的筛选
根据吸光值范围从0.5到1.2缺乏分析物，选择最佳的包被原结合物浓度，血清稀释滴度，酶标示踪剂。使用非竞争性ELISA检测血清对不同包被原的亲和力，通过稀释血清从1/1,000 - 1/64,000，测定抗血清的结合。包被原浓度为0.01 到 0.25 mg L-1。同理，通过抗体包被ELISA滴度从0.125 - 2.0 mg L-1检测酶标追踪物，板子包被血清浓度从1/1,000到 1/10,000。
4. 抗体包被形式
ELISA板被包被100uL/每孔经CB适度稀释的抗体，4℃过夜。第二天用PBS-T洗板6次，每孔加入50 uL 溶于PBS-T的HRP-半抗原和50 uL双蒸水，室温孵育1小时，洗干净后，通过每孔加入100 uL 底物(2mg/mLOPD和0.012%H2O2在25mmol/L柠檬酸钠盐，62mmol/L磷酸钠盐，PH5.5)检测HRP追踪活性，
5．结合物包被形式
ELISA板每孔加入100uL适当浓度的用CB稀释的OVA-半抗原包被，4℃孵育过夜。洗板6次，每孔加入50 uL 适度稀释的血清和50 uL双蒸水，室温孵育1小时进行竞争分析。洗板，然后加入100uL以1:4000的山羊抗兔抗体(GAR-HRP)，检测过氧化物酶活性。
6．最优化ELISA
对不同化学条件的影响(离子强度、pH值、表面活性剂浓度)进行了研究，检测免疫的敏感度。用PBS-T稀释 0，0.5，1.0，2.0，3.0 和 5.0，pH 7.5.检测离子的强度的有效性。PH的有效范围为4-9.5。表面活性剂的有效性为20吐温。
7. 交差反应的检测
通过测试一系列磺胺类药物和感染复合物的交差反应表达的百分比对STZ的特异性ELISA分析检测。
8. STZ标品的准备
STZ(24mg/mL)溶于0.5mol/LNaOH中，保存于4℃。用去离子水稀释成240 mg/L的工作液。用去离子水倍比稀释成标准溶液(STZ 浓度从2×10-4至2×10-2)，然后制备标准曲线。
文献：Specific polyclonal-based immunoassays for sulfathiazole. Nuria Pastor-Navarro, Cristina García-Bover, Ángel Maquieira and Rosa Puchades. Analytical and Bioanalytical Chemistry. Volume 379, Numbers 7-8 (2004), 1088-1099, DOI: 10.1007/s00216-004-2683-1
